長島型掌跖角化病二例SERPINB7基因突變研究

多麗娜 汪慧君 林志淼 楊勇

100034北京大學第一醫院皮膚科

·論著·

長島型掌跖角化病二例SERPINB7基因突變研究

多麗娜 汪慧君 林志淼 楊勇

100034北京大學第一醫院皮膚科

目的 報告2例長島型掌跖角化病，確定其致病基因突變。方法 收集患者及其父母外周血和臨床資料，提取基因組DNA，PCR擴增SERPINB7基因8個外顯子及其側翼序列，對擴增產物進行DNA測序以查找基因突變位點，并以200例無關健康人DNA作為對照進行擴增測序。結果 2例患者均存在SERPINB7基因c.796C>T純合突變，導致編碼蛋白質第266位氨基酸出現終止改變（p.R266*），其父母均為c.796C>T雜合突變，而無關健康對照未發現上述突變。結論 SERPINB7基因的c.796C>T突變可能是引起2例患者長島型掌跖角化病的原因。

皮膚角化病，掌跖；皮膚表現；DNA突變分析；基因，SERPINB7；長島型掌跖角化病

掌跖角化病（palmoplantar keratoderma,PPK）是一組復雜的以掌跖皮膚肥厚和過度角化為主要特征的先天性遺傳病，包括數十種不同亞型［1］。長島型掌跖角化病（Nagashima-type palmoplantar keratosis,NPPK,OMIM 615598）屬于彌漫性非殘毀性掌跖角化病，是一種常染色體隱性遺傳病。最近，Kubo等［2］確定NPPK的致病基因為編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子B亞型7的SERPINB7基因。目前已報道的NPPK患者主要來自日本，我們在臨床上收集到2例中國NPPK患者，并檢測其SERPINB7基因突變情況。

對象與方法

一、臨床資料

2例患者均為散發病例。例1女，24歲，出生時即出現掌跖部紅斑、脫屑，并逐漸加重擴展，累及手、足背部，伴輕度手、足多汗，反復出現趾間真菌感染。例2女，25歲，出生時出現掌跖部皮膚潮紅、角化，后出現皮膚增厚、脫屑，逐漸加重并進展至手、足背部，伴有輕度手、足多汗及反復足癬、甲癬病史。體檢：2例患者均可見雙手掌、足底、指趾背部、手足背邊緣、指趾背側面、手腕內側、踝及跟腱處有彌漫性紅斑伴角化及脫屑，角化處皮膚呈輕度增厚，角質層略呈淡黃色，部分區域因多汗出現浸漬發白。例2肘部及膝部可見輕度紅斑及角化，足部數個趾甲遠端變脆、分離，真菌鏡檢呈陽性。2例患者手、足浸水數分鐘后角質層均發生明顯變白伴輕度腫脹（圖1）。2例患者均未見毛發或牙齒異常。否認家族史及父母近親婚育史。2例患者采用10%尿素和5%水楊酸軟膏外用，皮疹輕度緩解，停藥后很快復發。

二、實驗方法

1.外周血基因組DNA提取：本研究經北京大學第一醫院倫理委員會同意，患者及其家屬簽署知情同意書。取患者、父母和200例健康對照者的外周血4 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，用試劑盒提取基因組DNA（產自北京天根生化科技有限公司）。

2.PCR引物設計和合成：根據SERPINB7基因序列（來源于Ensembl網站，網址：http://www.ensembl.org/index.html），利用 Primer-BLAST 在線版（網址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計8對特異性引物，覆蓋SERPINB7基因8個外顯子及其側翼序列，引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

3.PCR反應體系及條件：PCR反應體系25μl，含基因組 DNA50ng，dNTPs0.4mmol/L，MgCl22.0mmol/L，上下游引物各10 μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U。PCR反應條件：95℃預變性5 min后，94℃變性30 s，62℃退火30 s（每個循環依次降0.5℃），72℃延伸 45 s，10個循環；94℃變性 30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環；最后72℃延伸9min，4℃保存。取5 μl PCR擴增產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

4.PCR產物測序分析：所有PCR產物純化后送至北京天一輝遠生物科技有限公司測序，測序方法為Sanger雙脫氧鏈終止法（Sanger法）。測序結果采用Bioedit軟件與SERPINB7基因組序列進行比對。

結 果

以患者的基因組DNA為模板，所有引物的PCR產物經凝膠電泳均可見目標條帶，產物切膠純化后測序，結果清晰無雜峰干擾。將所測得的序列與 Ensembl數據庫（http://www.ensembl.org/index.html）公布的正常序列進行對比，得到如下結果：2例患者SERPINB7基因第8外顯子中第796位核苷酸（從cDNA編碼起始位點ATG算起）發生C→T純合突變（c.796C>T）（dbSNP:rs142859678），導致其編碼蛋白質在第266位氨基酸出現終止改變（p.R266*），其父母均為c.796C>T突變攜帶者（圖2），無關正常對照未發現此突變。所有突變均由反向測序得到驗證。

圖1 患者皮損表現 1A：例1手背與手掌交界處紅斑角化；1B：例2足背、足踝、跟腱處彌漫性紅斑及角化，部分趾甲變脆、增厚及遠端分離；1C：例2肘部輕度紅斑及角化；1D：例2雙手掌彌漫性紅斑及角化，略呈淡黃色，遇水后角質層發白，輕度腫脹（右手）

圖2 SERPINB7基因突變測序圖（箭頭指示突變位點） 2A：患者SERPINB7基因c.796C>T純合突變；2B：患者父母攜帶c.796C>T雜合突變；2C：無關正常對照測序結果

討 論

NPPK通常表現為出生時至3歲以內出現掌跖部位彌漫性紅斑及角化，可累及手足背部、腕內側、踝和跟腱部位，遇水后角化皮膚可出現發白改變［3-4］。皮疹穩定，不隨年齡增長出現明顯進展或加重。患者常伴有手掌和足底多汗，易伴發皮膚淺表真菌感染［3］。NPPK需要與Mal de Meleda掌跖角化病、Bothnia型掌跖角化病鑒別。Mal de Meleda同樣為常染色體隱性遺傳，但其掌跖角化為進展性，隨年齡增長逐漸加重，且角化通常更為嚴重，多伴有甲受累及口周、肛周的紅斑角化［4］；而Bothnia型掌跖角化病為常染色體顯性遺傳，盡管臨床表現與NPPK較為類似，但是Bothnia掌跖角化通常多汗更為嚴重，可伴有輕度甲改變，而且遇水后角質發白及腫脹更迅速且更明顯［5-6］。

最近，Kubo等［2］對3例無關日本NPPK患者進行全外顯子組測序分析，確定NPPK的致病基因為SERPINB7基因。通過Sanger測序，進一步分析另外10例無關NPPK患者的SERPINB7基因外顯子序列，最終發現這13例患者中6例患者存在SERPINB7的c.796C＞T純合突變，另外7例患者為c.796C＞T雜合突變伴其他功能缺失性雜合突變。該作者通過千人基因組數據庫（1 000 Genomes Project）中SERPINB7基因突變位點的分布情況分析，發現c.796C＞T（rs142859678）雜合突變在日本和中國的正常人群中攜帶頻率分別為2/89和6/197，然而該突變位點未見于千人基因組數據庫中歐洲及其他非洲裔的正常人群。因此推斷，NPPK可能主要流行于亞洲，特別是日本和中國。SERPINB7基因編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子B亞型7，具有抑制絲氨酸蛋白酶的作用，可保護細胞免于蛋白酶介導的損傷［7］。SERPINB7分布于全身表皮，表達于顆粒層及角質層［8］。SERPINB7的酶觸反應中心位于第331～352位氨基酸，保持核心功能區的完整性是維持酶活性的基本條件［9］，因此發生于該催化區域之前的截短突變可以導致NPPK患者表皮內顆粒層和角質層SERPINB7蛋白酶活性抑制作用喪失，表皮內SERPINB7的減少可使絲氨酸蛋白酶活性增強，導致角質形成細胞蛋白降解合并角質層結構破壞，加速水分滲透到角質層，從而引發一系列臨床表現［2］。

本研究組近期檢測了7例中國漢族NPPK患者的SERPINB7基因突變情況，發現4例患者帶有c.796C＞T純合突變，2例患者為c.796C＞T雜合突變同時伴其他功能缺失性雜合突變，1例患者為c.522-523insT純合突變，提示SERPINB7基因的c.796C＞T突變很可能是中國漢族NPPK患者最常見的致病性突變位點［10］。本研究中2例NPPK散發患者均為SERPINB7基因c.796C＞T純合突變所致，確定該突變位點可能是中國人NPPK最常見的突變位點。先前的研究證實，c.796C＞T突變存在祖先效應（founder effect），即該位點很可能來源于中國漢族的某一共同祖先［10］，這對該病的快速診斷有非常重要的意義。由于正常漢族人群攜帶該雜合突變位點的比例高達3%，因此，在中國NPPK很可能是最常見的常染色體隱性遺傳性掌跖角化病之一。臨床上散發的、非殘毀性、彌漫性掌跖角化病患者需考慮NPPK的診斷，在進行基因檢測確診時，可以優先檢測SERPINB7基因c.796C＞T突變位點。此外，由于正常人群中攜帶SERPINB7基因致病性突變位點比率較高，因此進行遺傳咨詢時，應建議患者配偶也進行相應基因攜帶情況的排查。

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Mutation analysis of the SERPINB7 gene in two patients with Nagashima-type palmoplantar keratoderma

Duo Lina,Wang Huijun,Lin Zhimiao,Yang Yong

Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China

Objective To report two cases of Nagashima-type palmoplantar keratoderma（NPPK）,and to identify mutations in the SERPINB7 gene.Methods Clinical data were collected from two patients with NPPK and their parents,and peripheral blood samples were obtained from the two patients,their parents and 200 unrelated healthy controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR was performed to amplify 8 exons and their flanking sequences of the SERPINB7 gene followed by DNA sequencing.Results A homozygous mutation （c.796C>T）,which led to the formation of a premature termination codon at amino acid position 266 （p.R266*）,was identified in both of the two patients.However,the patients′healthy parents were heterozygous carriers of the mutation（c.796C>T）.No mutation was found in the unrelated healthy controls.Conclusion The mutation c.796C>T in the SERPINB7 gene may be responsible for NPPK in the two patients.

Keratoderma,palmoplantar;Skin manifestations；DNA mutational analysis;Genes,SERPINB7;Nagashima-type palmoplantar keratosis

Lin Zhimiao,Email:zhimiaolin@bjmu.edu.cn

林志淼，Email：zhimiaolin@bjmu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.007

北京市高等學校青年英才計劃項目（YETP0069）

Fund program:Beijing Higher Education Young Elite Teacher Project（YETP0069）

2015-05-04）

（本文編輯：尚淑賢）