傳染性牛支原體肺炎流行的診斷方法

摘要：本文主要探討傳染性牛支原體肺炎流行的診斷方法，分析了輝南縣2013年新引進育肥肉牛呼吸道傳染病進行病原學研究。總結傳染性牛支原體肺炎防治當中要找準原因，加強疾病預防和飼養管理，早診斷早治療，以此增強傳染病防治效果。

關鍵詞：傳染性；支原體肺炎；診斷

中圖分類號： S858.23 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.18.038

牛支原體是危害養牛業的重要致病性支原體，目前已證實該病原體呈世界性分布，可導致牛群發生多種病癥，致死率高，常規抗生素治療效果差，且病情容易反復，犢牛及體弱牛病死亡率高[1]。

1 資料與方法

1.1 樣本采集

采集血液和肺等各種內臟器官作為檢查標本。采集途徑：重癥病牛或死后不久病牛，剖檢取樣；依據養殖戶病情報告剖檢具有典型癥狀病牛取樣；養殖戶直接送檢病牛。

1.2檢測方法

1.2.1支原體培養鑒定 在PPLO固體培養基（Sigma公司生產）上涂抹小塊組織樣本，操作均在無菌環境中進行，培養基中放置PPLO肉湯粉（BD公司）、瓊脂粉（BD公司）、酵母粉（BD公司），并將于含5%二氧化碳的細胞培養箱中放置固體培養基進行培養并采用光學顯微鏡觀察。鑒定標準：支原體菌落形態發生變化，液體培養基發生顏色變化。

1.2.2支原體種群鑒定 在150毫升滅菌水的Ep-pendorf管中放入小塊帶支原體菌落的瓊脂，先煮沸10分鐘，再冰浴1分鐘，行血清分離后取上清作為DNA模板。采用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，其產物克隆至質粒pMD18-T中，通過專業生物工程技術公司進行序列測定。

1.2.3細菌分離鑒定 在103kPa高壓下將40克TSA瓊脂與1000毫升蒸餾水混合物蒸氣滅菌，蒸氣20分鐘，制備出TSA固體培養基；在1000毫升蒸餾水中加入TSB粉30克混合，在103 kPa高壓下蒸氣滅菌20分鐘，制備出TSB培養基。在無菌操作標準下于TSA固體培養基表面涂抹小塊組織樣本切面，并采用接種環將組織對樣本劃線于37℃培養過夜，第2天觀察細菌分離情況、菌落形態特征。另外，取純化單菌落放置于TSB液體培養基離心（轉速200轉/分鐘，時長30秒），然后行藥敏測驗。

1.2.4牛結核診斷 參照“動物結核病診斷技術GB/T 18645-2002”鑒定牛結核菌素皮內變態反應、牛結核菌抗酸染色、牛結核菌培養情況。采用四抗原融合蛋白抗體ELISA進行牛結核抗體ELISA檢測。

1.2.5泰勒蟲檢測 對血涂片進行姬姆薩染色并使用光學顯微鏡觀察，依據18S rRNA基因序列設計特異性引物進行PCR擴增，對泰勒蟲感染進行鑒定。

1.2.6藥敏試驗 對已經分離出的細菌與支原體進行藥敏測驗，主要方法為藥敏紙片法，使用的試紙（杭州天和微生物試劑有限公司生產）包括恩諾沙星、氧氟星、潔霉素、頭孢類、氨芐青霉素、氯霉素等。一切操作嚴格按照規定進行，判斷標準參考說明書。

2 結果

2.1病牛臨床癥狀

牛群發病月齡集中于3月齡至1年左右，多數于引進1周后發病，發病品種多為西門答爾牛與本地黃牛的雜交品種。臨床表現：發熱（體溫42℃）持續3～4天，食欲不振、毛粗亂無光澤、咳嗽氣喘、腹瀉（糞水樣帶血），伴隨膿性鼻汁、關節炎等，犢牛、體質較差牛病情更為嚴重。經分析可見主要是病牛胸腔與肺部發生病理變化。

2.2支原體檢測結果

在不含青霉素支原體培養基中檢測顯示為陰性，另外一個培養基中肺組織病料均為支原體分離陽性。在16S rRNA擴增產物測序分析發現，牛支原體為所分離支原體，與GenBank中牛支原體16S rRNA序列、無乳支原體16S rRNA序列同源性高達99%。

2.3牛結核檢測結果

病牛肺組織抗酸染色、結核菌素皮內變態反應檢測均為陰性，后對該地區育肥肉牛結核抗體檢測均為陰性。

2.4細菌分離鑒定結果

不同場所的育肥肉牛以及育肥肉牛不同器官組織細菌分離情況呈現差異。檢出細菌為：葡萄球菌、鏈球菌、G-短桿菌。

2.5血樣泰勒蟲檢測結果

本研究中共采集了30個血樣，22份呈現陽性，血樣環形泰勒蟲檢出率為（73.3%）；采用顯微鏡深入檢查，發現不同牛場中育肥肉牛紅細胞中都存在泰勒蟲。

2.6藥敏試驗

細菌、支原體耐藥性嚴重，不同牛場的牛支原體藥敏性存在明顯差異，其中環丙沙星居于第一位，其次為左氟沙星、四環素。針對細菌而言，先鋒V、頭孢拉定、丁胺卡那效果較為理想。

3 結語

傳染性牛支原體肺炎既可使牛發生急性呼吸系統疾病，還會導致持續感染，常與細菌、病毒協同作用，導致多種抗生素治療效果差。牛一旦感染，可持續帶菌成為傳染源，因此早期進行干預有助于傳染病盡早控制，具有重要的臨床意義[2]。早期應用抗生素治療效果明顯，可根據藥敏實驗結果使用敏感藥物，例如可選擇環丙沙星，部分菌株可使用四環素，另外用藥時要保證足夠的劑量和科學的療程。此外本研究中還發現牛群中具有較高的泰勒蟲感染率，可采用貝尼爾或咪唑苯脲針對性治療，提高牛群的抵抗力[3]。

綜上所述，傳染性牛支原體肺炎防治當中要找準原因，加強疾病預防和飼養管理，早診斷早治療，以此增強傳染病防治效果。

參考文獻

[1] 段甫美，趙加發，肖開順，等.牛傳染性支原體肺炎的診治[J].云南畜牧獸醫，2012（03）：24-25.

[2] 何金箭.傳染性支原體肺炎在肉牛養殖中的診斷[J].中國畜禽種業，2015，11（06）：77-78.

[3] 李知新，王進香，閆小芹，等.寧夏牛支原體肺炎RT-PCR方法的診斷[J].中國動物檢疫，2012，29（01）：44-45.

作者簡介：王忠琴，大專學歷，輝南縣輝發城鎮畜牧獸醫站，獸醫師，研究方向：動物檢疫。