聚乳酸可吸收根管樁膜生物相容性實驗

趙哲珊 黃華 邱榮敏 韋克珍 李麗媚

廣西醫科大學附屬口腔醫院兒童牙病科，南寧 530021

聚乳酸可吸收根管樁膜生物相容性實驗

趙哲珊 黃華 邱榮敏 韋克珍 李麗媚

廣西醫科大學附屬口腔醫院兒童牙病科，南寧 530021

目的 檢測通過溶劑揮發成膜法制備的聚乳酸可吸收根管樁膜的生物相容性。方法 采用溶劑揮發成膜法制備聚乳酸根管樁膜，進而制備聚乳酸樁膜浸提液，檢測聚乳酸樁膜的生物相容性。體外培養人牙齦成纖維細胞（HGF），用聚乳酸樁膜浸提液培養HGF，采用形態學觀察法、四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、流式細胞術檢測HGF的形態學變化、細胞毒性反應及活細胞率。將HGF接種于聚乳酸樁膜上，通過4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察HGF在聚乳酸樁膜上的生長情況。將聚乳酸樁膜植入到SD大鼠皮下，于第1、4、8、12周從動物背部取出植入材料及周圍皮下組織，觀察切口大體表現，并對組織行蘇木精-伊紅染色，通過觀測炎癥細胞浸潤程度檢驗材料對局部組織炎癥和異物反應的情況。結果 聚乳酸樁膜浸提液對HGF的增殖無明顯影響，無明顯細胞毒性；HGF可在聚乳酸樁膜上黏附和生長。皮下植入實驗：實驗組標本的大體觀察和蘇木精-伊紅染色觀察結果均與對照組相似，符合生物安全性要求。結論 通過溶劑揮發成膜法制備的聚乳酸可吸收根管樁膜具有良好的生物相容性，可用于進一步臨床研究。

溶劑揮發法； 聚乳酸； 根管樁； 乳牙； 生物相容性

隨著生物可吸收材料的發展，聚乳酸（polylacticacid，PLA）類材料已廣泛應用于臨床，最常見的是用于骨科內固定[1-2]。基于乳恒牙替換的生理現象，乳牙殘根殘冠的治療也逐漸向可吸收根管樁修復方向發展，并取得了良好的效果[3]。目前的主要問題在于沒有相應的可吸收黏結劑，多使用玻璃離子黏結劑粘接修復乳牙殘根殘冠，但玻璃離子黏結劑是不可吸收性材料，對乳恒牙替換存在隱患。采用溶劑揮發成膜法制備成與PLA螺紋樁材質相同的PLA樁膜，可作為PLA可吸收螺紋樁的輔助固位與封閉材料。由于在樁膜制備過程中使用了有機溶劑氯仿，因此本研究的目的在于觀察PLA根管樁膜的生物相容性，為臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養基（Hyclone公司，美國），胰蛋白酶（Sigma公司，美國），胎牛血清（維森特公司，加拿大），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（上海生工生物工程有限公司），四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]（Sigma公司，美國），鼠抗人波形絲蛋白抗體、鼠抗人細胞角蛋白抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Inion OTPS?醫用PLA可吸收接骨螺紋樁、細胞凋亡試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）溶液（北京索萊寶科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色劑（福州邁新生物技術開發有限公司）。ELX-800型酶標儀（Bio-Rad公司，美國），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），CO2培養箱（Forma scientific公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。AO-820型組織切片機（美國光學AO公司），OLYMPUSBX41型光學顯微鏡（Olympus公司，日本）。SD大鼠（廣西醫科大學動物實驗中心）。

本研究于口腔頜面修復與重建研究實驗室（廣西壯族自治區重點實驗室）、頜面外科疾病診治研究實驗室（廣西高校重點實驗室）中完成。

1.2 方法

1.2.1 PLA樁膜及PLA樁膜浸提液的制備 將Inion OTPS?醫用PLA可吸收接骨螺紋樁0.4 g和氯仿20 mL置于棕色瓶中，密閉保存，讓其充分溶解呈油狀；將0.2 mL溶解液涂布在7 mm×20 mm的醫用載玻片上，置于37 ℃干燥箱中干燥48 h后，得到寬7 mm、長20 mm的薄膜[4]。

將PLA樁膜經環氧乙烷滅菌處理后，按照中華人民共和國醫療器械生物學評價標準的規定，將無菌試樣放入無菌試管，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃培養箱中培養72 h獲取浸提液。要求試樣浸提液量與試樣表面積的比率為6 cm2·mL-1，制備出PLA樁膜浸提液備用。陰性對照組為含10%胎牛血清的DMEM培養基，陽性對照組為含0.64%苯酚的10%胎牛血清DMEM培養基。

1.2.2 人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGF）的培養及初步鑒定 牙齦組織取材于廣西醫科大學口腔醫院口腔頜面外科門診因正畸拔牙且無牙齦炎癥的患者（牙齦組織為正畸牙牙頸部粘連的部分牙齦組織，取材均經患者知情同意后進行）。患者年齡12～18歲。獲取的牙齦組織用含青霉素和鏈霉素的PBS溶液和無血清培養液各反復沖洗3遍，去除血液，手術剪剪碎，要求組織塊大小＜1 mm3。將小塊組織均勻鋪開，接種于50 mL細胞培養瓶中，加入少量含胎牛血清的DMEM培養液，在飽和濕度、37 ℃并含5%CO2標準環境下培養。倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，當鋪滿培養板面積的80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，培養基更換為含胎牛血清的DMEM。

取生長狀態良好的第4代HGF，制備細胞爬片，用SABC法進行波形絲蛋白和角蛋白染色，進行細胞來源鑒定，光鏡觀察。

取生長狀態良好的第4代HGF，待細胞爬滿瓶底50%后，實驗組更換為PLA可吸收根管樁膜浸提液培養，陰性對照組仍使用10%胎牛血清的DMEM培養液培養，陽性對照組更換為含0.64%苯酚的10%胎牛血清DMEM培養液培養，待陰性對照組細胞爬滿瓶底80%時，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。

1.2.3 細胞毒性試驗（MTT 法） 取第4代生長良好的人HGF接種于96孔板，每塊孔板隨機分為陰性對照組（每孔加200 μL含10%胎牛血清的DMEM培養液），實驗組（每孔加200 μL PLA可吸收根管樁膜浸提液），陽性對照組（每孔加200 μL含0.64%苯酚的10%胎牛血清DMEM培養液）。在37 ℃、5%CO2條件下培養，分別于誘導培養后1、3、5、7 d，向每孔加MTT液20 μL，每時間點各8孔。37 ℃孵育4 h后加DMSO（每孔150 μL），600 r·min-1振蕩10 min，用酶標儀在490 nm處測定吸光度A值，求均值并記錄結果，得到各組的細胞生長曲線，重復實驗3次。按以下公式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR=實驗組A值/空白對照組A值×100%。根據細胞毒性分級標準（RGR≥100%，毒性分級為0級；RGR為75%～99%、50%～74%、25%～49%、1%～ 24%、0%時，毒性分級分別為1、2、3、4、5級），將各組RGR值轉化為0～5級材料毒性評級。

1.2.4 細胞凋亡檢測 取第4代HGF置于75 cm2培養瓶中，加含10%胎牛血清的DMEM，在37 ℃、5%CO2條件下培養，待細胞長至50%時，實驗組更換PLA可吸收根管樁膜浸提液為培養基，對照組為含10%胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養，待細胞匯合至80%時，用流式細胞儀檢測細胞的存活率。

1.2.5 DAPI染色 取第4代HGF，接種于PLA可吸收樁膜上，培養48 h后除去細胞培養液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗去固定液。加入DAPI染色液，常溫下避光染色10 min。PBS洗滌3次，每次5 min。置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 PLA可吸收樁膜皮下植入實驗 將Inion OTPS?醫用PLA可吸收接骨螺紋樁截為3.5 mm長，PLA樁膜裁剪為3.5 mm×20 mm大小。將PLA樁膜以逆時針方向纏繞在PLA可吸收螺紋樁上，每截可吸收螺紋樁纏繞3片薄膜為實驗組。對照組為不纏繞樁膜的PLA可吸收螺紋樁。

選擇24只180～220 g的雌性SD大鼠進行實驗。大鼠經1%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于實驗臺上，背部去毛，消毒后鋪無菌巾，沿脊柱兩側縱行做兩個長5 mm左右的切口，相互間距大于10 mm。用鈍器在皮下制備皮囊，使囊的末端距切口大于10 mm，且能輕松放入實驗材料。按隨機法分組，一個皮囊內植入實驗組材料，另一個皮囊內植入對照組材料，縫合手術切口，聚維酮碘消毒切口。所有動物手術后繼續飼養。于第1、4、8、12周4個時間點從動物背部取出植入材料及周圍皮下組織，觀察切口的大體表現。標本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，制備組織切片，HE染色，通過觀察炎癥細胞的浸潤程度檢測各組材料的局部組織炎癥和異物反應情況。

1.2.7 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 細胞來源鑒定及形態學觀察結果

倒置顯微鏡下觀察可見，約7 d左右，HGF從組織塊游出，生長狀態良好，為成纖維樣細胞，傳代后細胞生長旺盛，性狀穩定。第4代細胞呈長梭形，胞體豐滿，細胞質均勻，細胞核呈圓形或卵圓形，核仁清晰。免疫細胞化學結果顯示：HGF抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性（圖1），提示培養的細胞為間充質來源細胞。PLA浸提液誘導培養后，實驗組與陰性對照組比較，細胞形態無明顯差異；陽性對照組細胞形態改變，細胞凋亡增多。

2.2 細胞毒性檢測

實驗組、陰性對照組和陽性對照組的細胞生長曲線見圖2：陰性對照組和實驗組HGF在4個時間點的增殖能力差異均無統計學意義（P＞0.05），但均高于陽性對照組（P＜0.05）。隨著培養時間的延長，陰性對照組和實驗組A值相應增加，換算成細胞毒性級別如下：實驗組在第1天細胞毒性分級為1級，第3、5、7天均為0級，陽性對照組均為4級。該結果提示，PLA根管樁膜無明顯的細胞毒性。

圖 1 HGF來源鑒定 光學顯微鏡 × 200Fig 1 HGF sources identification optical microscope × 200

圖 2 各組HGF的細胞生長曲線Fig 2 Cell growth curves of HGF in each group

2.3 細胞凋亡檢測

流式細胞分析結果顯示，對照組活細胞百分率為92.5%，實驗組活細胞百分率為88.8%，均在正常范圍內，表明PLA根管樁膜浸提液對HGF的生長無明顯影響。

2.4 DAPI染色

DAPI染色結果見圖3：細胞核呈典型藍色熒光，提示PLA可吸收根管樁膜表面有成纖維細胞黏附和生長。

2.5 PLA可吸收樁膜皮下植入實驗

2.5.1 手術后大體標本觀察結果 1）術后1周，實驗組可見背部皮膚切口愈合良好，切口無膿腫、感染。肉眼觀察大體標本可見植入材料與周圍組織接觸良好，未見明顯移位，材料周圍有大量的炎癥肉芽組織增生。對照組標本所見與實驗組基本相同。2）術后4周，實驗組可見大鼠背部切口完全愈合，局部無紅腫和積液；材料未見移位，周圍被致密纖維組織包裹，囊壁較厚。對照組標本所見與實驗組基本相同。3）術后8周，實驗組材料未移位，可見纖維結締組織包裹，組織與材料結合緊密。對照組標本所見與實驗組基本相同。4）術后12周，實驗組材料未移位，可見大量纖維結締組織包裹，與材料接觸緊密，分離困難。對照組標本所見與實驗組基本相同。

2.5.2 HE染色 兩組的HE染色結果見圖4。1）術后1周，實驗組材料周圍組織可見較多的炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞及淋巴細胞為主，無組織壞死；對照組材料周圍也有類似反應。2）術后4周，實驗組可見淋巴細胞、成纖維細胞、漿細胞和單核細胞浸潤；對照組也有類似反應。3）術后8周，實驗組以纖維結締組織增生為主，炎癥細胞數目明顯減少，纖維細胞的數目和比例均增大；對照組也有類似反應。4）術后12周，實驗組炎癥反應不明顯，可見大量的成纖維細胞和較少量的炎癥細胞；與對照組沒有明顯區別。

圖 3 DAPI染色 熒光顯微鏡 × 100Fig 3 DAPI staining fluorescence microscope × 100

圖 4 實驗組和對照組的組織學檢測 HE × 200Fig 4 Histology detection of experimental group and control group HE × 200

3 討論

乳牙殘冠殘根常因無可吸收修復材料而拔除，乳牙早失不僅會影響患兒的美觀和發音，還會影響乳恒牙替換與頜骨發育[5-6]。隨著生物材料學的發展，越來越多的可吸收材料應用于臨床。目前常用的可吸收材料主要為聚乳酸類，例如PLA、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物等制品。因為這些材料具有良好的力學性能、生物降解性能和生物學性能，所以得到越來越多的關注[7]。

目前尚無與乳牙可吸收樁配套的可吸收粘接系統。借鑒水暖安裝工程[8]中以高分子材料聚四氟乙烯生料帶封閉螺紋連接管道，使管內物質不向外泄露的方法，采用溶劑揮發成膜法制備與PLA可吸收樁材質相同的PLA可吸收樁膜，可以作為樁的固位與封閉材料，為PLA可吸收樁提供了可以同步吸收的粘接系統。研究[9-10]表明，PLA可吸收樁膜的封閉性能與玻璃離子粘接劑相似，對根管封閉性能良好，且可吸收根管樁纏繞樁膜修復殘根后的抗折力能滿足臨床需求，可用于乳牙殘根殘冠的修復。

因為在可吸收樁膜制備過程使用了有機溶劑氯仿，故需進行生物相容性實驗，以便檢測其安全性。生物學評價包括細胞毒性試驗、動物實驗和臨床前試驗[11]。體外細胞毒性試驗對口腔材料的初級篩選起到了非常重要的作用，節約了大量的資源和時間。此外，細胞實驗還可直接觀察細胞與材料的復合生長情況，操作相對簡單，可控性強[12]。動物實驗較細胞實驗結果更接近人體實際，彌補了體外實驗難以模擬的綜合反應。由于沒有一種實驗能夠完全反映出材料的生物相容性，故細胞毒性試驗和動物實驗均是口腔材料生物相容性評價不可或缺的環節。

本實驗結果表明：PLA可吸收根管樁膜對HGF生長無明顯影響，毒性評級為0～1級，無毒；HGF可在樁膜上生長；加入浸提液培養后，活細胞百分率與對照組無明顯差別；大鼠組織大體觀察和HE染色觀察結果與對照組相似，符合生物安全性要求。由此可以推測，PLA根管樁膜的出現可以推進PLA根管樁在臨床上的使用，為乳牙殘根殘冠修復提供了新的手段。

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（本文編輯 吳愛華）

Biocompatibility of polylactic acid-absorbable root post film

Zhao Zheshan, Huang Hua, Qiu Rongmin, Wei Kezhen, Li Limei.
(Dept. of Pediatric Dentistry, Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)

Supported by: Clinical Research Funds Project for Oral Health Promotion and Oral Medicine Development in Western of China Hold by Chinese Stomatological Association (CSA-W2012-01). Correspondence: Huang Hua, E-mail: huanghua58430@ 126.com.

Objective To study the biocompatibility of the polylactic acid (PLA)-absorbable root post film prepared by solvent evaporation film. Methods The PLA post film-leaching liquor was prepared by the solvent evaporation of PLA root post films, and its biocompatibility was measured. Sources of human gingival fibroblasts (HGF) were cultivated in vitro and identified initially by the immunohistochemistry method. The toxicity reaction, survival rate, and morphological change of HGF incubated in PLA post film-leaching liquor were observed and tested by morphological observation, 3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, and flow cytometry. The HGF were implanted on the PLA post film and observed by 4’,6-diamidino-2-phenylindole staining. After implanting the PLA post film, the surrounding subcutaneous tissue of SD rats and the implants were removed from the back of the rats in the 1st, 4th, 8th, and 12th weeks to observe the general condition of the incisions. The organization was given the hematoxylin-eosin (HE) stain to find the organization condition of local tissue inflammation and foreign body reaction through the infiltration degree of inflammatory fibroblasts. Results The effects of the PLA post film-leaching liquor on the proliferation of HGF and fibroblast toxicity were insignificant. The living fibroblast rate was similar to the normal control group. The HGF were able to grow on the PLA film. The results of the organization general observation and HE staining of the rats were similar to the results for the control group, which met all the demands made by biological safety. Conclusion The PLA-absorbable root post film prepared by the solvent evaporation film has good biocompatibility and can be used for further clinical research.

solvent evaporation method; polylactic acid; root post; deciduous teeth; biocompatibility

R 788

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.006

2016-04-05；

2016-07-02

中華口腔醫學會口腔健康促進與口腔醫學發展西部行臨床科研基金（CSA-W2012-01）

趙哲珊，碩士，E-mail：zhaozheshan@126.com

黃華，主任醫師，碩士，E-mail：huanghua58430@126.com