馬尾松松針提取物對根面牙本質脫礦影響的體外研究

唐成芳阮建平朱勇李子夏左艷萍徐紅艷

1.西安醫學院口腔醫學系，西安 710021；2.西安交通大學口腔醫院預防科，西安 710004；3.陜西省人民醫院口腔科，西安 710076

馬尾松松針提取物對根面牙本質脫礦影響的體外研究

唐成芳1阮建平2朱勇1李子夏1左艷萍1徐紅艷3

1.西安醫學院口腔醫學系，西安 710021；2.西安交通大學口腔醫院預防科，西安 710004；3.陜西省人民醫院口腔科，西安 710076

目的 評價馬尾松松針提取物（PMNE）抑制根面牙本質脫礦的效果。方法 將根面牙本質塊根據pH循環中所用實驗溶液隨機分為去離子蒸餾水（DDW）組，氟化鈉（NaF）組，4%、8%和12%PMNE組，試件進行為期8 d的pH循環。顯微CT選區測定各組未脫礦牙本質和脫礦牙本質的牙本質礦物密度（DMD）及兩者DMD差值（ΔDMD），掃描電鏡下觀察pH循環后牙本質表面形貌。結果 PMNE各組和NaF組ΔDMD均顯著低于DDW組（P<0.05），且8% PMNE組和12%PMNE組ΔDMD組間差異無統計學意義（P>0.05），均顯著低于4%PMNE組，高于NaF組（P<0.05）。掃描電鏡見PMNE組牙本質小管不全暴露，小管開口程度明顯小于DDW組，大于NaF組。結論 PMNE可抑制根面牙本質脫礦，減緩酸對DMD的降低，具有一定的抗齲活性。8%PMNE即可達到較好抑制脫礦的效果。

馬尾松松針提取物； 根面齲； 牙本質； 脫礦； 礦物密度

根面齲是發生在牙頸部涉及牙骨質、牙本質的特殊齲壞。老年人因牙齦退縮以及牙頸部薄弱部位暴露，更易發生根面齲[1-2]。據第3次全國口腔健康流行病學調查報告，全國65～74歲老年人患齲率為98.4%，根齲患病率為63.6%，根面齲是老年人牙齒缺失的主要因素之一，嚴重危害著老年人的口腔健康[1,3]。因而，采用合理、安全有效的措施防治根面齲的發生和發展是非常必要的。研究[4-5]證實齲病的發生發展是牙體組織在細菌產酸作用下，發生的礦物質溶出和有機物的崩解。因而，控制菌斑，增強礦物牙體組織抵抗酸/耐脫礦能力，促進脫礦組織再礦化被認為是“應用微創理念”防治老年齲進展的重要措施[5-6]。

松針，又稱松葉松毛，是松科松屬植物的葉，性溫味苦，自古記載其具有補益人體、祛風止痛、活血化淤、固齒駐顏等功效。研究證實松針提取物有抑菌/抗菌、抗衰老、抗腫瘤等多種生物學活性[7-9]，也被用于牙膏的研制[10]。本實驗采用顯微CT（micro computer tomography, Micro-CT）和場發射掃描電鏡（field emission scanning electron microscopy，FESEM）分析了我國廣泛分布的馬尾松松針提取物（Pinus massoniana needle extract，PMNE）對根面牙本質抗酸/抑制脫礦能力的影響，探索PMNE抑制根面齲的潛能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和器械

10∶1 PMNE（西安奧賽生物技術有限公司），氟化鈉（NaF，分析純）、磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純）、乙酸（CH3COOH，分析純）（西安化學試劑廠），羥乙基哌嗪乙磺酸（Sigma公司，美國），抗酸指甲油（Revlon公司，美國）。

采用去離子蒸餾水（distilled deionized water，DDW）為溶劑配制如下溶液。4%、8%和12%PMNE溶液：將PMNE加入DDW中配制質量體積百分濃度為12%的澄明溶液，DDW稀釋方式配制4%和8%的PMNE溶液，備用；用DDW溶解適量NaF配制成0.1% 的NaF溶液；中性緩沖液：20 mmol·L-1羥乙基哌嗪乙磺酸，1.5 mmol·L-1KH2PO4，pH為7.0[11]；酸性緩沖液：50 mmol·L-1CH3COOH，1.5 mmol·L-1KH2PO4，pH為5.0[11]。

慢速切割機（UNIPOL-830，沈陽科晶有限公司），恒溫水浴箱（上海醫療器械廠），維氏顯微硬度計（HXD-1000TM，上海泰明光學儀器有限公司），FE-SEM（FESEM S-4800，Hitachi公司，日本），Micro-CT（Explore Locus SP，通用醫療公司，美國），電感耦合等離子質譜儀（熱電有限公司，美國）。

1.2 樣本制備

取頸部平坦且完整無齲壞的新近拔除第三磨牙35顆，用慢速切割機在流水降溫下去除冠方牙體組織，制備3 mm×4 mm×2 mm的根面牙體組織塊。在流水降溫下用2 000目碳化硅砂紙打磨牙體表面至牙本質層，并使牙本質表面光滑平整。按照文獻[12]的方法，用顯微硬度計挑選出牙本質表面硬度在35～50維氏硬度值之間的試件50個。在牙本質的光滑表面一端預留3 mm×2 mm大小的開窗區，其余部位均勻涂布抗酸指甲油，干透后涂布第二層。

1.3 實驗分組及pH循環

按照所用實驗溶液不同，將50個試件隨機分為5組，分別為DDW、NaF、4%PMNE、8%PMNE和12%PMNE組，每組10個試件，其中DDW組和NaF組分別作為陰性和陽性對照組。

各組試件分別于37 ℃的恒溫水浴箱中進行pH循環：2 mL4%PMNE、8%PMNE、12%PMNE溶液、DDW或0.1%NaF等實驗溶液浸泡10 min，2 mL酸性緩沖液1 h，2 mL中性緩沖液緩沖5 min。每次浸泡后用DDW徹底沖洗1 min，濾紙吸去多余水分，其余時間各試件放入37 ℃中性緩沖液中，每天緩沖3次，共8 d。各實驗液及中性緩沖液每日更換1次。

1.4 牙本質礦物密度（dentin mineral density，DMD）的測定

循環結束后DDW徹底沖洗，室溫下用3%戊二醛溶液與0.1 mol·L-1PBS緩沖液（1∶1，pH=7.2）固定4 h，去除牙本質表面涂布的指甲油，DDW徹底沖洗。將試件置于Micro-CT中在80 kV、80 μA、14 μm層厚條件下進行掃描，三維重建。測定每個標本未脫礦側約0.996 0 mm×0.996 0 mm大小面積（圖1A中黃色區域），且自牙本質表面向內深0.220 4 mm的長方體形區域內（即0.996 0 mm×0.996 0 mm×0.220 4 mm選區，圖1B中黃色所示區域）的DMD，作為該樣本未脫礦牙本質的礦物密度（normal dentin mineral density，NDMD），每個標本測定4個區域，計算平均值。具體測定方法見圖1。

按照未脫礦側DMD同樣測定的方法，將未脫礦側分析選區框水平平移至同一牙本質塊脫礦側的對稱位置，測定同樣大小選區內的DMD，即作為pH循環后脫礦牙本質的礦物密度（demineralized dentin mineral density，DDMD），每個標本測定4個區域，求平均值。按照如下公式計算牙本質塊NDMD與DDMD的差值（ΔDMD），ΔDMD=NDMD-DDMD。

1.5 表面微觀形貌觀察

試件經Micro-CT掃描完成后即刻用DDW沖洗，自然干燥，噴金，FE-SEM電鏡觀察各組脫礦側牙本質表面微觀形貌。

圖 1 牙本質密度測定選區圖Fig 1 Selected area analysis in determination of dentin density

1.6 PMNE中鈣、鉬和氟含量測定

取4%PMNE溶液稀釋100倍，采用電感耦合等離子體質譜儀，測PMNE中鈣、鉬和氟元素的含量，共測定5個樣。每個樣品測定3次，求平均值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件對NDMD、DDMD及ΔDMD進行單因素方差分析，采用組間LSD兩兩比較，檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 DMD測量結果

各組NDMD、DDMD和ΔDMD測量結果見表1。

表 1 各組NDMD、DDMD和ΔDMD的比較Tab 1 The comparison of NDMD， DDMD and ΔDMD in each groups mg·cm-3， n=10

表 1 各組NDMD、DDMD和ΔDMD的比較Tab 1 The comparison of NDMD， DDMD and ΔDMD in each groups mg·cm-3， n=10

注：不同小寫字母代表NDMD、DDMD和ΔDMD等指標組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。

由表1可見，各組NDMD間差異無統計學意義（P>0.05）。DDW組DDMD最低，NaF組DDMD最高，兩組間DDMD差異有統計學意義（P<0.05）；4%PMNE組DDMD明顯高于DDW組，顯著低于8%、12%PMNE組和NaF組（P<0.05）；8%PMNE組和12%PMNE組比較差異無統計學意義（P>0.05），均略低于NaF組，但差異無統計學意義（P>0.05）。DDW組ΔDMD最高，NaF組△DMD最低，兩組間差異有統計學意義（P<0.05）；PMNE各組ΔDMD顯著高于NaF組，顯著低于DDW（P<0.05）；8%PMNE 組ΔDMD略低于12%PMNE組，但兩組間差異無統計學意義（P>0.05），兩者均顯著低于4%PMNE組（P<0.05）。

2.2 表面微觀形貌觀察結果

各組pH循環后脫礦牙本質表面微觀形貌見圖2。由圖2可見，DDW組牙本質表面牙本質小管完全暴露，小管開口呈圓形或類圓形，牙本質表面欠平整，未見明顯膠原纖維，牙本質小管壁較疏松，可見膠原纖維。NaF組牙本質表面的玷污層完整，未見牙本質小管暴露，表面僅見3～5 μm長度的狹小微裂隙。低倍鏡下各濃度PMNE組牙本質表面的玷污層完整性受到不同程度破壞，牙本質小管口部分堵塞，呈不同程度的點隙狀開口；4%PMNE組牙本質表面點隙最大，分布最密集。高倍鏡下見4%PMNE組牙本質表面牙本質小管口暴露不全，裂隙呈3～5 μm線狀和多角形不規則開口，但牙本質小管開口程度較DDW組明顯減小；8%和12%PMNE組牙本質表面的部分牙本質小管被堵塞，部分牙本質小管口不全暴露，呈3～5 μm長的梭形/小的不規則形開口，兩組牙本質表面的點隙狀開口基本相當，點隙大小和密集程度明顯小于4%PMNE組。

2.3 PMNE中鈣、鉬和氟含量

本樣品中鈣元素含量為（12.46±0.23） μg·mg-1，鉬元素含量為（3.31±0.12） μg·mg-1。本樣品不含氟元素。

圖 2 各組牙本質表面微觀形貌 FE-SEMFig 2 Micro morphology of dentin surface in every group FE-SEM

3 討論

口腔中的致病菌可利用食物產酸致使釉質、牙本質等牙體硬組織發生脫礦，繼而脫礦裸露的膠原纖維等有機基質在酶和唾液環境中降解，導致齲病發生發展[4-5]。本實驗在pH循環模式下，以NaF作為對照觀察富含黃酮類化合物的PMNE抑制根面牙本質脫礦的作用，并分析PMNE濃度效應，為預防根面齲的發生及抑制其進展提供實驗依據。此外，為避免緩沖液對實驗結果的干擾，本實驗pH循環所用的酸性和中性緩沖液均不含鈣離子。

Micro-CT是采用X線成像原理進行超高分辨率三維成像的設備，可在不破壞樣本的情況下，定量計算樣品內部任意選定區域的體積、面積、孔隙率、礦物密度等[13]。礦物密度是根據體模和標準CT值計算得到并以單位體積的羥磷灰石含量來表示的礦物質含量，可反映單位組織內礦物質的含量[14]。牙本質等牙體組織是以無機物為主的硬組織，具有X線阻射，因而Micro-CT也被用于測定牙體組織的礦物含量和齲病動態過程及療效觀察[15]。本研究采用Micro-CT定量對比分析各組根面牙本質脫礦區、正常未脫礦等大選區內礦物密度值和兩者礦物密度差，以評價PMNE抑制酸所致牙本質脫礦的效果。結果表明，NaF和PMNE均可有效抑制根面牙本質脫礦的進展。

由于能夠促進牙體組織礦化和減弱酸對牙體組織的脫礦，故氟化物干預是當前減輕齲病進展的有效措施。本實驗Micro-CT也證實NaF組牙本質脫礦區與未脫礦區的ΔDMD顯著低于DDW組，提示0.1% NaF能有效地減弱酸對根面牙本質的脫礦作用。FESEM見NaF組牙本質表面玷污層完整而DDW組玷污層完全破壞，進一步證實了氟化物提高牙本質耐脫礦或抑制脫礦的能力。研究[12]表明，氟化物在牙本質/釉質表面可與鈣離子或羥磷灰石結合形成氟化鈣或氟磷灰石，增強根面牙本質抗酸蝕脫礦能力，促進再礦化。

本實驗也證實PMNE可抑制酸所致牙本質脫礦，其機制推測主要可能與PMNE保存脫礦牙本質有機基質有關。牙本質是含有約30%有機基質的鈣化硬組織，已有研究[16]表明保留脫礦牙本質內的有機基質可為再礦化提供支架，并形成一個機械屏障從而阻止酸的擴散和礦物離子釋出。PMNE是從馬尾松葉中提取的天然物質，其主要分子結構具有多個酚羥基的原花青素、黃酮類等生物活性成分[8-9]。原花青素、五倍子等含多酚結構的物質可通過共價鍵、離子鍵、氫鍵等與蛋白質反應，增加交聯度，增強膠原基質，使非膠原蛋白凝固，抑制金屬基質蛋白酶活性，減輕脫礦牙本質的降解[8,11-12,16]。據此推測，PMNE抑制根面牙本質脫礦的可能機制是PMNE通過原花青素、黃酮類等有效成分的多酚結構與膠原基質的相互作用，增強了膠原基質的交聯，抑制其降解，從而保存了脫礦牙本質有機基質并形成屏障。該屏障可一定程度阻礙pH循環過程中的H+擴散從而減輕脫礦。另外，由于原花青素的交聯作用以及其B環上酚羥基的螯合作用[8,12]，交聯于脫礦牙本質膠原基質的原花青素還可以通過B環上酚羥基螯合因脫礦釋出的部分鈣離子，從而阻礙鈣離子釋出。因而，雖經pH循環，PMNE組牙本質玷污層未完全被酸去除，表現為牙本質小管仍部分堵塞，而陰性對照DDW組玷污層完全被去掉，牙本質小管完全暴露，且PMNE組ΔDMD顯著低于DDW組。

此外，PMNE抑制根面組織脫礦的作用可能還與PMNE中含有的鈣元素和鉬元素相關。松針提取物中還含有鈣、磷、鉬等多種元素。本研究采用質譜儀也證實本實驗所用PMNE中含有（3.31±0.12） μg·mg-1鉬元素，（12.46±0.23） μg·mg-1鈣元素。據此推測，一方面PMNE溶液中所含鈣可沉積在脫礦牙本質表面，能促進表面的殘余羥磷灰晶體生長；另一方面PMNE處理后，其內鉬元素沉積于脫礦牙體表面，還可能增加牙本質抵抗pH循環中酸的侵蝕。據報道，增加攝入鉬元素可增強牙齒的硬度和牢固度，預防齲齒，還可提高氟再礦化表層下釉質的功效。然而鉬元素是如何發揮作用的機制還有待進一步研究。

本實驗中8%PMNE組和12%PMNE組抑制牙本質脫礦效果優于4%PMNE。結果提示，8%PMNE即可達到良好的抑制牙本質脫礦的效果。結果可能與單位體積高濃度PMNE溶液中多酚含量、鉬元素等有效成分相對較多有關，到8%濃度時PMNE即含有能與脫礦牙本質反應的最適量有效成分。然而，PMNE是混合物，其有效成分除原花青素和鉬元素外，是否還有其他抑制牙本質脫礦的成分還有待進一步研究。

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（本文編輯 杜冰）

Effect of Pinus massoniana needle extract on root dentin demineralization in vitro

Tang Chengfang1, Ruan Jianping2, Zhu Yong1, Li Zixia1, Zuo Yanping1, Xu Hongyan3.
(1. Dept. of Stomatology, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China; 2. Dept. of Preventive, School of Stomatology, Xi’an Jiao Tong University, Xi’an 710004, China; 3. Dept. of Stomatology, Shanxi Provincal People’s Hospital, Xi’an 710076, China)

Supported by: Tackling Project of Scientific and Technological Social Development from Science and Technology Department of Shanxi Province(2015SF242); Scientific Research Project from Education Department of Shanxi Province (15JK1625); Doctor Start Fund Project from Xi’an Medical University (2015DOC20); Key Discipline from Xi’an Medical University. Correspondence: Tang Chengfang, E-mail: tangchengfang@sohu.com.

Objective This study aims to evaluate the effects of Pinus massoniana needle extract (PMNE) on inhibiting demineralization of root dentin. Methods Root dentin blocks were randomly divided into distilled deionized water (DDW) group, fluoride sodium (NaF) group, and 4%, 8% and 12% PMNE groups according to the experimental solution used in the process of pH cycling in each group. All specimens in each group experienced pH cycling for 8 d. The dentin mineral density （DMD） of the normal dentin and demineralized dentin and their D-value （ΔDMD） were determined using micro computed tomography. The morphology of dentin surface after pH cycling was also observed using a scanning electron microscope. Results The ΔDMD values in all PMNE groups and the NaF group were considerably lower than the ΔDMD in the DDW group (P＜0.05）. The ΔDMD values of the 8% and 12% PMNE groups had no difference （P>0.05), both of which were lower than the ΔDMD in the 4% PMNE group and higher than that in the NaF group （P<0.05). The dentin tubules were partly opened in the PMNE groups. The opening degrees of the dentin tubule in PMNE groups were significantly less and smaller than the opening degree in the DDW group and were larger than that in the NaF group. Conclusion PMNE can inhibit the demineralization of root dentin and can slow down the reduction in DMD. PMNE has the potential to prevent caries, and 8% PMNE can effectively inhibit dentin demineralization.

Pinus massoniana needle extract; root caries; dentin; demineralization; mineral density

R 781.1

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.018

2016-03-15；

2016-06-22

陜西省科技廳社會發展項目（2015SF242）；陜西省教育廳科研課題（15JK1625）；西安醫學院博士啟動基金（2015DOC-20）；西安醫學院重點學科資助

唐成芳，副教授，博士，E-mail：tangchengfang@sohu.com

唐成芳，副教授，博士，E-mail：tangchengfang@sohu.com