犬牙周膜中神經纖維的形態特點及分析

曾曉華蔡巧玲宮蘋

1.廈門大學附屬第一醫院口腔科，廈門 361003；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院種植科（四川大學），成都 610041

犬牙周膜中神經纖維的形態特點及分析

曾曉華1蔡巧玲1宮蘋2

1.廈門大學附屬第一醫院口腔科，廈門 361003；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院種植科（四川大學），成都 610041

目的 通過免疫組織化學染色方法鑒定犬牙周膜中神經纖維的性質。方法 獲取健康成年比格犬第二前磨牙近中至第三前磨牙遠中牙槽骨頰舌側下牙槽神經管上方的完整牙槽骨塊，制作硬組織切片后進行S100、神經絲蛋白（NFP）免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察犬牙周膜中的神經分布。結果 犬牙周膜中分布的S100（+）組織呈以下幾種形態：密集環形組織聚成不同直徑的束狀結構；條形纖維狀伴行于管腔狀結構；游離末梢狀或橢圓形片層狀深染結構。NFP（+）組織分布特點與S100（+）相似，但形態主要為不同直徑條索狀纖維結構，呈束狀、游離末梢狀或分枝狀散布于牙周膜膠原纖維束中。結論 S100免疫組織化學結果可初步判斷犬牙周膜中神經纖維的結構，NFP免疫組織化學結果可比較神經軸突的粗細區分神經類型，從而有助于鑒定犬牙周膜中神經纖維的性質。

牙周膜； 神經纖維； 免疫組織化學

咀嚼系統是由咀嚼肌、顳下頜關節和咬合組成的受神經系統調控的功能整體，其中牙周膜內分布的神經組織負責將咬合產生的機械刺激傳入中樞神經系統，協調咀嚼運動[1]。牙周膜中的傳入纖維被認為是咀嚼系統感覺傳入的一個重要組成部分，其末端的感受器能感知和傳遞牙周膜內的刺激信號，引起多種反射活動，協調咀嚼系統的運動和功能。目前研究認為哺乳動物牙周膜內存在兩種感受器：力感受器和傷害性感受器，但未見明確對應的解剖形態學結構報道[2]。這些感受器，可將牙齒受到的咀嚼力等刺激信號通過三叉神經的分支傳入中樞神經系統，調節咀嚼肌的收縮活動。

分布于牙周組織中的神經組織可分為有髓神經纖維和無髓神經纖維，本研究將從組織形態學方面對犬天然牙牙周膜內神經纖維的分布和形態進行觀察分析，并對應用免疫組織化學染色方法鑒定牙周膜中神經纖維性質的可行性進行初步探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

18月齡健康成年比格犬1只（四川大學華西醫學實驗動物中心提供），體重12 kg，實驗前飼養1周。

1.2 獲取、制作實驗標本

1.2.1 獲取標本 將犬以0.03 g·kg-1戊巴比妥鈉麻醉后，切取第二前磨牙近中至第三前磨牙遠中牙槽骨頰舌側下牙槽神經管上方的完整牙槽骨塊，術中注意冷卻，術后立即浸泡于4%中性多聚甲醛溶液中固定1周。

1.2.2 制作硬組織標本 將固定好的標本用流水沖洗，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明；依次用第1、2和3滲透液（第1滲透液：甲基丙烯酸甲酯75 mL，鄰苯二甲酚二丁酯25 mL，二甲苯100 mL；第2滲透液：甲基丙烯酸甲酯75 mL，鄰苯二甲酚二丁酯25 mL，過氧化苯甲酰1 g；第3滲透液：甲基丙烯酸甲酯75 mL，鄰苯二甲酚二丁酯25 mL，過氧化苯甲酰2～5 g）分別滲透24 h。將配制好的包埋液（甲基丙烯酸甲酯75 mL，鄰苯二甲酚二丁酯25 mL，過氧化苯甲酰5 g）充分攪拌后用濾紙過濾，移入容量為10 mL的圓柱狀平底玻瓶中，將犬牙槽骨標本頰側朝下放入瓶內浸泡，蓋緊有孔瓶蓋。放循環水，用真空泵抽真空4～6 h，37 ℃水浴過夜聚合。將包埋好的標本瓶砸碎取出包埋塊。

1.3 硬組織切片的制備

用切割機粗修包埋塊后，移至切片機上切成5 μm薄片，水浴60 ℃裱片，鉻礬明膠貼片，置50～60 ℃烤箱中烘烤2～3 d后染色。用脫塑液在60 ℃烤箱中對切片進行脫塑2次，再轉移到梯度乙醇去脫塑液后，水洗[3]。

1.4 免疫組織化學染色

將脫塑后水化的切片，按常規石蠟切片免疫組織化學方法進行一抗為anti-S100抗體和anti-神經絲蛋白（neurofilament protein，NFP）抗體（Abcam公司，美國）的免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察犬牙周膜中的神經分布。

1.5 圖片采集

染色后用Nikon Eclipse E600顯微鏡和與電腦連接的Nikon數碼相機采圖系統進行采圖。

2 結果

2.1 S100免疫組織化學染色

光鏡下，犬牙周膜中分布的S100（+）組織多數分布于牙根根尖段，偏近牙槽骨側，主要呈以下幾種形態：1）犬前磨牙牙周膜內可見明顯的大小不等、排列略有差異的圓環狀結構，圓環的中央為一圓點或小圓圈狀結構，其外周的圓環內呈空泡或網格狀結構，外緣有一顏色稍深的環形細線形成界限，另可見數個細胞核分布其間，形成密集環形組織組成束狀結構，其形態特征與有髓神經纖維束狀結構相似。2）S100（+）組織伴行于管腔狀結構周圍。3）S100（+）組織呈游離末梢狀或特殊的橢圓形片層狀深染結構。牙周膜中不同部位的S100（+）區域陽性表達強度不均勻（圖1）。

圖 1 犬牙周膜中S100（+）組織學分布 免疫組織化學染色 × 400Fig 1 The distribution of S100 positive tissue in the periodontal liga- ment of dogs immunohistochemistry staining × 400

2.2 NFP免疫組織化學染色

光鏡下，犬天然牙牙周膜中分布的NFP（+）組織形態呈軸索狀，著色較均勻一致。分布特點基本與S100免疫組織化學染色一致，多數分布于牙根根尖段，根中和根上段分布較少。組織學形態具有以下特點：不同直徑的條索狀纖維結構，呈束狀、游離末梢狀或分枝狀散在分布于牙周膜膠原纖維束中。其中NFP（+）束狀結構主要分布在血管腔周圍，而游離末梢狀結構主要穿插分布于牙周膜的膠原纖維束中，游離末梢的直徑大于束狀結構中軸索的直徑（圖2）。

圖 2 犬牙周膜中NFP（+）組織學分布 免疫組織化學染色 × 200Fig 2 The distribution of NFP positive tissue in the periodontal ligament of dogs immunohistochemistry staining × 200

3 討論

牙周膜組織中存在的神經包括感覺神經和自主神經，其中自主神經的功能是支配血管收縮功能，牙周組織中的感覺神經才具備感受器功能[4]。本實驗觀察發現，部分牙周膜中的神經符合有髓神經典型特征的束狀結構，而另一部分呈S100反應陽性的橢圓形片層狀深染結構以及NFP反應陽性的不同直徑、結構特點的神經纖維。這些結構中既包括感覺神經也包括自主神經。Williams等[5]研究認為，外周神經纖維根據傳導速度的不同可分為三類。A類：有髓的軀體傳入和傳出纖維，依據其平均傳導速度分為α、β、γ、δ四類，對應直徑分別為13～22、8～13、4～8、1～4 μm；B類：有髓的植物性神經的節前纖維，直徑1～4 μm；C類：無髓的軀體傳入纖維dγC和植物性神經節后纖維sC，直徑分別為0.3～1.3、0.4～1.2 μm。牙周膜中的感覺神經包括A類和C類的傳入纖維dγC；自主神經為C類的植物性神經節后纖維sC。

A類和C類神經纖維在結構上不同：A類為有髓神經，C類為無髓神經。本研究中S100免疫組織化學顯示有髓神經的典型結構。因此，能從神經纖維的顯微結構對A類和C類神經進行區別。對牙周膜中A類和C類纖維進行的研究[6-8]表明，Aδ和C類纖維參與傷害感受，而Aβ纖維具有機械感受功能，其細胞體分別位于三叉神經節（trigeminal ganglion，TG）和中腦三叉神經核（mesencephalic trigeminal nucleus，MS）[9]。

S-100蛋白的分子結構可由α和β兩種亞基組成三種不同的形式，即S100ao（S-100αα）、S100a（S-100αβ）和S100b（S-100ββ）三種亞型，其中S100b蛋白只存在于哺乳動物的中樞和周圍神經系統及黑色素細胞中。免疫組織化學和免疫細胞化學的研究進一步發現，周圍神經系統中S100b蛋白只存在于雪旺細胞，在其胞漿和胞膜中表達，軸索中缺乏S100b蛋白[10]。有髓神經纖維中央的軸突不表達S100，因此有髓神經纖維免疫組織化學染色的橫切面表現為大小不等的圓環狀結構，內環中為直徑不等的邊緣深染的中空結構——軸突，深染的內環邊緣為表達S100的雪旺細胞內緣胞質和胞膜；環內淡染的空泡狀結構為髓鞘；髓鞘外緣是深染的細線，即雪旺細胞外緣的胞質和胞膜，構成神經纖維的界限。雖然包裹無髓神經軸突的雪旺細胞胞膜和胞漿也為S100 （+），但由于其結構是由許多軸突自雪旺細胞胞膜表面內陷形成，因此神經纖維表面的胞質和胞膜成分均較少，且無髓神經纖維的直徑較小，因此推斷S100染色可能較淺。無髓神經纖維中雪旺細胞的胞核位于纖維的中央，無髓神經纖維的外周也有基膜，因此神經外周同樣可見細長的成纖維細胞核分布于薄層結締組織中，結構特征不典型。本研究觀察發現，牙周膜中同一視野不同部位的S100（+）組織陽性表達強度存在差異，可能與不同的神經類型（有髓或無髓）有關。

有髓神經和無髓神經這兩類神經纖維結構不同，S100免疫組織化學染色可作為區分二者的一種方法。由于神經周圍突在接近終末端處髓鞘消失，有髓神經和無髓神經的末梢軸突均裸露成游離的末梢分布于終末組織中，S100免疫組織化學不能顯示軸突，因此進一步判斷神經類型具有局限性。

NFP是一種細胞骨架蛋白，廣泛存在于動物的成熟神經元中，是神經絲的主要組成成分。外周感覺神經和運動神經對NFP具有穩定的免疫反應性，因此NFP被認為是顯示神經的一種可靠有效的方法[11]。神經纖維中的軸突NFP免疫組織化學染色陽性，神經纖維的粗細與其軸突的直徑正相關，軸突越粗包裹的髓鞘也越厚，形成的神經纖維的直徑就越大。因此，NFP顯示的軸突直徑反映神經纖維的粗細。本研究顯示NFP陽性組織分布與S100相似，但顯示的形態結構與其不同，呈質地均勻一致的纖維狀結構、直徑大小不一的游離末梢狀或分枝狀。各類神經的差異主要體現在直徑大小。本研究顯示可根據S100染色初步判斷神經的結構，再通過NFP染色比較神經軸突（即神經直徑）的粗細，在顯微鏡下觀察視野內選取同一神經纖維不同節段，通過測量其縱剖面寬度取均值，并參照不同類型神經纖維直徑參數，從而進一步區分判斷神經類型。

綜上，本研究通過對牙周膜內神經纖維的免疫組織化學染色，從顯微水平對牙周膜中神經纖維的類型進行初步的識別區分，為今后進一步深入的研究提供了顯微水平的形態學基礎。

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（本文編輯 李彩）

Morphological features and analysis of the nerve fibers in the periodontal ligament of dogs

Zeng Xiaohua1, Cai Qiaoling1, Gong Ping2.
(1. Dept. of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361003, China; 2. State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Dental Implants, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Supported by: National Natural Science Foundation of China (30772448; 81170995). Correspondence: Gong Ping, E-mail: dentistgong@hotmail.com.

Objective To identify the properties of nerve fibers of dogs by immunohistochemical staining method. Methods Intact bone blocks above the inferior alveolar nerve canal were cut from the medial of the second premolar to the distal of the third premolar of healthy adult Beagle dogs of 18 months, embedded to make hard tissue sections, stained with S100 and neurofilament protein (NFP) antibodies, and finally observed the nerve distribution under the microscope. Results The distribution of S100 positive tissue in the periodontal ligament of dogs showed the following patterns: bundles of densely gathered rings with different diameters, filaments accompanied by lumens, free endings and deep-dyeing oval lamellasome. The location of NFP positive tissue was similar to that of S100 positive tissue, but the distribution of these NFP positive filaments with various diameters showed largely as bundles, free ending and branches scattering in periodontal membrane. Conclusion We may firstly distinguish the structure of the nerve fibers in periodontal ligament of nerve distribution, and then judge the categories of the nerve fibers by S100 immunohistochemistry furtherly according to comparison of the thickness of neural axon by NFP immunohistochemistry, and finally distinct the function and attribute of the nerve fibers in the periodontal ligament of dogs.

periodontal ligament; nerve fiber; immunohistochemistry

R 78

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.005

2016-03-28；

2016-06-06

國家自然科學基金（30772448，81170995）

曾曉華，主治醫師，博士，E-mail：zxhmm@126.com

宮蘋，教授，博士，E-mail：dentistgong@hotmail.com