雙三氟甲烷磺酰亞胺類離子液體對產紫青霉菌株全細胞催化特性的影響

張　馨, 李　揚, 曹　紅, 歐陽巧鳳,, 鄭蘭蘭,4, 李　春

(1. 石河子大學化學化工學院, 石河子 832003; 2. 嘉興學院生物與化學工程學院, 嘉興 314001;3. 北京理工大學生命學院, 北京 100081; 4. 喀什大學化學與環境科學學院, 喀什844006)

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雙三氟甲烷磺酰亞胺類離子液體對產紫青霉菌株全細胞催化特性的影響

張馨1, 李揚1, 曹紅2, 歐陽巧鳳1,2, 鄭蘭蘭1,4, 李春3

(1. 石河子大學化學化工學院, 石河子 832003; 2. 嘉興學院生物與化學工程學院, 嘉興 314001;3. 北京理工大學生命學院, 北京 100081; 4. 喀什大學化學與環境科學學院, 喀什844006)

研究了雙三氟甲烷磺酰亞胺陰離子Tf2N-分別與5種不同陽離子組成的離子液體對產紫青霉菌(PenicilliumpurpurogenumLi-3)的生長、 代謝、 細胞膜透性及全細胞催化活性的影響. 結果表明, [N1,4,4,4]Tf2N對產紫青霉菌的生長有促進作用, [Py14]Tf2N, [Bmim]Tf2N, [BPy]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N 4種離子液體對產紫青霉菌的生長則均有不同程度的抑制. 代謝活力保留值R的測定結果表明, [P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N對產紫青霉菌體細胞表現出相對較高的生物相容性; 5種離子液體對菌體細胞的細胞膜透性均有改善作用. 全細胞催化反應數據顯示, 最優離子液體為[Py14]Tf2N, 當其加入量為25%, 反應84 h后, 單葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)產率高達95.38%. 5種離子液體對產紫青霉菌的生長、 代謝、 細胞膜透性及全細胞催化活性的影響不僅與陰離子Tf2N-有關, 陽離子的組成、 結構和性質也發揮重要的作用.

雙三氟甲烷磺酰亞胺陰離子; 陽離子; 離子液體; 產紫青霉菌; 單葡萄糖醛酸基甘草次酸

全細胞生物轉化過程的反應介質主要有水和有機溶劑兩大體系, 與水相中的生物催化反應相比, 非水相介質中生物催化反應具有較特殊的優勢, 然而酶的立體選擇性和催化活性一般會受到傳統有機溶劑的限制, 有機溶劑本身的毒害性會對細胞膜造成一定程度的破壞, 從而影響催化效率, 同時也會造成化學工業污染. 針對這一問題, 目前較多使用新型的綠色溶劑離子液體(ILs)作為生物催化反應的介質.

將離子液體/水雙相體系應用于生物催化反應, 既可以充分利用離子液體能夠促進生物催化活性和環境友好的特點, 又能克服底物或產物在水相中溶解度低、 不穩定及反應物對催化反應產生抑制等缺點[1]. Sch?fer等[2]在甲基叔丁基醚(MTBE)和10種不同離子液體中對8種不同脂肪酶和2種酯酶的活性進行了檢測, 結果顯示, 在離子液體[Mmim]Tf2N雙相體系中脂肪酶Pseudomonas和Alcaligenes的對映體選擇性比在MTBE中顯著提高, 且酶在離子液體[Mmim]Tf2N, [Omim][PF6]和[Bmim]5[CF3SO3]中可以保持良好活性. Robert等[3]發現疏水性離子液體[NMeOct3][Tf2N]和[P6,6,6,14]5[Tf2N]作為催化介質均能提高重組E.coli細胞對甲苯雙加氧催化的效率, 這2種離子液體對E.coli細胞都具有良好的生物相容性, 離子液體/水雙相體系可有效保護細胞免受底物甲苯的毒害作用; 與水相體系相比, 細胞對甲苯的耐受性提高了8倍, 產物甲苯順乙二醇濃度提高了2.5倍; Kohlmann等[4]在短乳桿菌乙醇脫氫酶催化難溶于水的脂肪族酮類還原反應中使用水溶性離子液體作為添加劑, 提高了反應的立體選擇性; Lourenco等[5]發現1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯與A型明膠形成的離子凝膠包載氧化酶的催化效果良好, 當基質濃度大于0.15 mmol/L時, 包載后的辣根過氧化物酶還能保持91%的初始酶活性, 而游離的辣根過氧化物酶則已失活, 說明離子液體與明膠復合材料能實現酶在較高濃度基質中的酶促反應; Lütz研究小組[6]報道了3種典型的電化學酶在水溶性離子液體中的催化合成反應, 發現在離子液體中還原型輔酶Ⅱ化學再生的空時產率提高了3倍; 在氨基酸氧化酶催化拆分外消旋蛋氨酸反應中, 酶輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸通過二茂鐵羧酸再生的空時產率提高了50%, 催化劑利用率也提高了140%; 此外, 在含離子液體的氯過氧化物酶催化(R)-苯基甲基亞砜過程中, 所需的共基質H2O2再生的空時產率和催化劑利用率增加了1～4.2倍不等, 增加多少主要取決于離子液體的類型[7].

當陰離子為雙三氟甲烷磺酰亞胺(Tf2N-)時, 大部分離子液體與水不互溶, 與緩沖溶液體系形成雙相體系. 在前期研究結果[8～12]的基礎上, 本文選用陰離子Tf2N-分別與5種不同陽離子組成的離子液體作為反應介質, 從產紫青霉(PenicilliumpurpurogenumLi-3)細胞的生長、 代謝、 細胞膜透性和催化活性等方面進行研究, 期望從離子液體的組成結構上找到離子液體對細胞催化作用的影響規律.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

產紫青霉PenicilliumpurpurogenumLi-3為本實驗室保存菌種. 甲基三丁基銨雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([N1,4,4,4]Tf2N)、N-甲基-N-丁基吡咯烷雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([Py14]Tf2N)、 1-丁基吡啶雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([BPy]Tf2N)、 己基三丁基膦雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([P6,4,4,4]Tf2N)和1-丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲烷磺酰亞胺鹽([Bmim]Tf2N), 純度均>98%, 購自中國科學院蘭州化學物理研究所; 其余試劑均為分析純.

LC-10A型高效液相色譜儀(HPLC)和光電二極管陣列(PDA)檢測器(日本島津公司); InertSustain C18柱(4.0 mm×250 mm, 日本GL Science公司); LCsolution型紫外檢測器(日本島津公司).

1.2離子液體對產紫青霉細胞生長活性的影響實驗

向5只錐形瓶中各加入100 mL基礎產酶培養基, 再分別加入2 mmol [BPy]Tf2N, [Py14]Tf2N, [N1,4,4,4]Tf2N, [P6,4,4,4]Tf2N和[Bmim]Tf2N 5種離子液體. 經滅菌、 冷卻及接種產紫青霉后, 于32 ℃, 150 r/min轉速下培養96 h, 取出, 抽濾, 將附著菌體的濾紙(已于80 ℃恒重)置于80 ℃恒溫干燥箱中恒重, 計算菌體干重[以細胞干重(DCW) g/L計]. 另取空白組[不接菌, 加入相同體積磷酸鹽(PB)緩沖液]和對照組(接菌, 加入相同體積PB緩沖溶液), 按照相同方法處理. 平行重復實驗3次, 取平均值.

1.3離子液體對產紫青霉細胞的生物相容性實驗

以產紫青霉細胞在離子液體中的糖代謝活力保留值(R)[13]來評價離子液體對產紫青霉菌株細胞的生物相容性. 將5種離子液體分別與PB緩沖溶液(0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, pH=7.0)按照體積比1∶1配成混合體系, 然后分別準確移取5 mL混合體系溶液加入6支10 mL離心管中, 離子液體體積分數分別為0, 6%, 10%, 14%, 20%和25%, 再各加0.15 g產紫青霉濕菌體, 于32 ℃, 150 r/min轉速下, 浸泡24 h后, 離心, 除去上層清液. 用生理鹽水(質量分數0.9%)洗滌菌體, 離心, 除去上層清液后, 加入5 mL葡萄糖溶液(1.0 g/L), 在32 ℃, 150 r/min轉速下振搖4 h, 離心. 準確移取1 mL上清液于25 mL容量瓶中定容, 采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)[14]法測定其中葡萄糖的含量. 另取空白組(將0.15 g濕菌體微波滅活后, 加入5 mL離子液體/PB緩沖溶液的混合體系中浸泡24 h)和對照組(將0.15 g濕菌體加入5 mL PB緩沖溶液中浸泡24 h)按照相同方法處理和測定, 計算R值. 平行重復實驗3次, 取平均值.

1.4離子液體對產紫青霉細胞膜透性的影響實驗

將5種離子液體分別與PB緩沖溶液(0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, pH=7.0)按照體積比1∶3配成混合體系, 然后分別準確移取5 mL混合溶液加入6支20 mL離心管中, 再各加入0.5 g濕菌體, 于32 ℃, 150 r/min轉速下振搖. 每隔2 h準確移取0.5 mL發酵液, 測定其中蛋白質[15]和核酸[16]的含量. 另取對照組(將0.5 g濕菌體加入5 mL PB緩沖溶液中)按照相同方法處理和測定. 平行重復實驗3次, 取平均值.

1.5離子液體對產紫青霉全細胞催化活性的影響實驗

取6支10 mL離心管, 分別加入4 mL含2.8 g/L甘草酸(GL)的底物溶液(由0.2 mol/L, pH=7.0的PB緩沖溶液配制)和0.15 g產紫青霉濕菌體, 按照一定的體積分數(0, 6%, 10%, 14%, 20%和25%)分別加入[BPy]Tf2N, [Py14]Tf2N, [N1,4,4,4]Tf2N, [P6,4,4,4]Tf2N和[Bmim]Tf2N 5種離子液體, 再用PB緩沖液(0.2 mol/L, pH=7.0)定容至6 mL. 置于常壓恒溫搖床上(32 ℃, 150 r/min)反應, 間隔一定時間取反應液離心(10000 r/min, 2 min)后, 移取0.5 mL上層清液, 用甲醇定容于10 mL容量瓶中, 過濾后, 用高效液相色譜檢測[17], 檢測波長254 nm, 流動相甲醇與重蒸水(加入適量醋酸, pH=2.85)體積比為81∶19, 流速為0.7 mL/min, 柱溫箱為40 ℃, 進樣20 μL. 取樣的時間間隔為20, 40, 60和84 h. 平行重復實驗3次, 取平均值.

1.6數據處理

高效液相色譜(HPLC)的主要儀器參數參見文獻[18]. 計算公式為YGAMG=PGAMG/S0(YGAMG為GAMG的產率,PGAMG為反應后產物GAMG的濃度,S0為反應前底物GL的初始濃度).

2　結果與討論

2.1離子液體對產紫青霉細胞生長活性的影響

由圖1可見, 在相同培養條件下, 與對照組相比, [N1,4,4,4]Tf2N對菌體生長有一定的促進作用, 這可能是因為[N1,4,4,4]Tf2N在培養基中能解離出銨離子, 給菌體提供了生長所需要的營養物質所致. [Bmim]Tf2N對菌體生長則產生了較明顯的抑制, 其次是[BPy]Tf2N, 而[Py14]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N對菌體生長抑制作用較弱, 這4種離子液體對菌株細胞生長的抑制作用可能與陰離子Tf2N-能夠強效抑制細胞內Na+-K+-ATP+酶的活性[19]有關, 而抑制作用的強弱則與陽離子的組成、 結構和性質有關.

Fig.1　　　　Influence of ionic liquid on the cell biomass a. Aqueous; b. [Bmim]Tf2N; c. [BPy]Tf2N; d. [Py14]Tf2N; e. [N1,4,4,4]Tf2N; f. [P6,4,4,4]Tf2N.

Fig.2　Metabolic activity retention(R) of Penicillium purpurogenum Li-3 cell in different ionic liquidsa. Aqueous; b. [Bmim]Tf2N; c. [BPy]Tf2N; d. [Py14]Tf2N; e. [N1,4,4,4]Tf2N; f. [P6,4,4,4]Tf2N.

2.2離子液體對產紫青霉細胞的生物相容性

糖代謝是細胞基本的代謝活動, 可用細胞糖代謝活力保留值R表征細胞的代謝活力和生長狀況. 若溶劑的毒性越小, 則R值越大, 表明溶劑對細胞的生物相容性越好[20]. 由圖2可知, 5種離子液體按照代謝活力保留值R由大到小的順序為[P6,4,4,4]Tf2N >[N1,4,4,4]Tf2N >[Py14]Tf2N >[Bmim]Tf2N >[BPy]Tf2N. 其中, [P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N的R值相近, 二者僅略低于水溶液的R值, 且比其它3種離子液體的R值均大, 說明這2種離子液體對產紫青霉Li-3菌體細胞表現出相對較高的生物相容性. 根據相關離子液體對微生物毒性研究[19]的報道, 由于這2種離子液體的陽離子結構中都不含有芳香烴或其它環狀結構, 親油性低, 且半徑比較大, 因此其對菌體細胞的潛在毒性較小, 對菌體代謝的抑制作用弱. 此外, 由圖2還可知, [BPy]Tf2N的R值最小, 表明在5種離子液體中, [BPy]Tf2N對菌體代謝活力的抑制作用最強. 這可能與[BPy]Tf2N的陽離子帶有芳香性的吡啶環有關. [Bmim]Tf2N和[Py14]Tf2N的陽離子分別帶有芳香性的吡咯環和飽和五元雜環, 這也是導致它們對菌體代謝活力的抑制作用相對較強的原因. 因此, 可以推斷陽離子結構上的差異是導致這5種離子液體對產紫青霉細胞毒性差異的根本原因.

2.3離子液體對產紫青霉菌株細胞膜透性的影響

如圖3所示, 在相同時間下, 5種離子液體介質中菌體細胞透出蛋白質和核酸的量不同; 對于同一種離子液體, 不同反應時間的細胞透出蛋白質和核酸的量也不相同. 這說明5種離子液體均對細胞膜透性有不同程度的改善作用, 這與離子液體的疏水基團可與細胞壁/脂質膜上的親脂基團發生相互作用[21]有關. 實驗測定的5種離子液體介質中, 透出蛋白質含量的順序為[Bmim]Tf2N>[BPy]Tf2N>[Py14]Tf2N>[N1,4,4,4]Tf2N>[P6,4,4,4]Tf2N, 透出核酸含量的順序為[Bmim]Tf2N>[BPy]Tf2N>[Py14]Tf2N>[P6,4,4,4]Tf2N>[N1,4,4,4]Tf2N. 說明[Bmim]Tf2N, [BPy]Tf2N和[Py14]Tf2N這3種離子液體對菌體透出蛋白質及核酸含量都比在水溶液和其它2種離子液體介質中多, 對細胞膜透性的改善作用較大; 而其它2種離子液體[P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N對細胞膜透性改善作用較小. 其原因可能是[P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N這2種離子液體的陽離子都不含環狀結構, 且半徑都比較大, 其對菌體細胞的潛在毒性較小, 因此對細胞膜的穿透作用較弱.

Fig.3　　　　Strain cell membrane permeability with proteins(A) and RNA(B) in 25%(volume fraction) different ionic liquids a. Aqueous aqueous; b. [BPy]Tf2N; c. [Py14]Tf2N; d. [N1,4,4,4]Tf2N; e. [P6,4,4,4]Tf2N; f. [Bmim]Tf2N.

2.4離子液體對產紫青霉全細胞催化反應的影響

在甘草酸生物轉化體系中分別加入5種離子液體, 考察了陽離子種類及添加離子液體濃度對產紫青霉全細胞催化進程的影響, 結果如圖4所示.

Fig.4　　　　Effect of ionic liquids with different volume fraction on the yield of GAMG (A)[Bmim]Tf2N; (B)[BPy]Tf2N; (C)[Py14]Tf2N; (D)[N1,4,4,4]Tf2N; (E)[P6,4,4,4]Tf2N; a. Aqueous; volume fraction of ionic liquid: b. 6%; c. 10%; d. 14%; e. 20%; f. 25%.

由圖4(A)可知, 隨著反應時間延長, 在5種離子液體介質中, GAMG產率均呈持續增加趨勢, 并且在反應20 h后, 5種離子液體介質體系中GAMG的產率均逐漸明顯高于純緩沖液體系.

從介質中離子液體的濃度變化分析可見, 當[Bmim]Tf2N體積分數為25%時, 反應84 h后GAMG產率達76.2%[圖4(A)]; 當反應84 h時, 在分別加入體積分數20%和25%[BPy]Tf2N體系中, GAMG產率均趨于60.9%[圖4(B)]; 反應20 h后, GAMG的產率在含不同濃度[Py14]Tf2N的介質體系中均比在純緩沖溶液體系中明顯提高, 并且GAMG產率隨著加入離子液體體積分數的增大而升高[圖4(C)], 當加入體積分數為25%, 反應84 h時, GAMG的產率達95.4%; 含不同濃度的[N1,4,4,4]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N介質體系對全細胞催化GL合成GAMG也同樣具有促進作用, 在加入體積分數為25%, 反應84 h時, 在[N1,4,4,4]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N介質體系中GAMG產率分別達81.2%和71.6%[圖4(D)和(E)].

全細胞催化活性的大小是由離子液體對細胞的生物相容性和細胞生長活性的影響、 離子液體對細胞膜通透性改善的程度以及離子液體中陰、 陽離子對酶催化活性的影響等多方面因素共同作用決定的. 5種離子液體對產紫青霉全細胞催化活性均具有促進作用, 這是因為其陰離子Tf2N-為疏水基團, 可以和細胞壁/脂質膜上的親脂基團相互作用而穿透細胞膜內, 其疏水性可導致胞內酶蛋白質周圍水的活性提高, 游離水分子促使酶蛋白趨于以活性增強的構象表達酶活性[21].

5種離子液體對全細胞催化促進作用的強弱順序為[Py14]Tf2N >[N1,4,4,4]Tf2N >[Bmim]Tf2N >[P6,4,4,4]Tf2N >[BPy]Tf2N. 由于[Bmim]Tf2N和[BPy]Tf2N的陽離子中含有芳香雜環, 對細胞的生長具有明顯的抑制作用, 且具有較強的毒性, 因此減小了離子液體對全細胞催化反應的促進程度. [P6,4,4,4]Tf2N對菌體生長雖然沒有明顯的抑制作用, 且具有較好的生物相容性, 但因其陽離子尺寸較大, 進入細胞內較困難, 對酶催化的促進作用較弱. [N1,4,4,4]Tf2N對菌體生長有一定的促進作用, 且生物相容性較好, 其陽離子尺寸也比[P6,4,4,4]Tf2N要小, 因此在陰離子的作用下, 相對較容易進入細胞內對酶催化反應產生促進作用. [Py14]Tf2N對細胞的生長活性略有抑制, 并且對菌體也有一定毒性, 但卻對全細胞催化反應表現出很強的促進作用. 這一特殊現象與Allen等[22]的實驗結果相似, 可解釋為這種離子液體能通過對細胞呼吸過程的抑制促使NADH和O2轉向高表達的生物催化過程, 從而阻止細胞對一些非生產性底物的消耗, 使反應向更有利于生成產物方向進行.

3　結　　論

研究了5種雙三氟甲烷磺酰亞胺類離子液體對產紫青霉菌生長、 代謝、 細胞膜透性以及全細胞催化活性的影響. 結果表明, 5種離子液體對產紫青霉菌生長、 代謝、 細胞膜透性及全細胞催化活性的影響與其陽離子的組成、 結構和性質密不可分; 與其它4種離子液體相比, [Py14]Tf2N在產紫青霉全細胞催化GL合成GAMG的過程中表現出更大的促進作用. 本文結果為雙三氟甲烷磺酰亞胺類離子液體應用于生物催化領域提供了理論依據.

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(Ed.: P, H, S, K)

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Effect of the Ionic Liquids with Anion Tf2N-on the Whole Cell Catalytic Properties ofPenicilliumPurpurogenumLi-3 Strain?

Zhang Xin1, LI Yang1, CAO Hong2*, Ouyang Qiaofeng1,2, Zheng Lanlan1,4, LI Chun3

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China; 2.CollegeofBiological,ChemicalSciencesandEngineering,JiaxingUniversity,Jiaxing314001,China; 3.SchoolofLifeScienceandTechnology,BeijingInstituteofTechnology,Beijing100081,China; 4.CollegeofChemistryandEnvironmentalScience,KashiUniversity,Kashi844006,China)

PenicilliumpurpurogenumLi-3 cells properties of growth, metabolism, permeability of cell membrane and catalysis were studied in five ionic liquids composed with anion Tf2N-and five different ca-tions. The results showed that, the ionic liquids [Py14]Tf2N, [Bmim]Tf2N, [BPy]Tf2N and [P6,4,4,4]Tf2N had inhibitory effect on the growth ofpenicilliumpurpurogenumLi-3 while ionic liquid [N1,4,4,4]Tf2N had a promoting effect. Through metabolic activity determination of retention value(R) in ionic liquids, [P6,4,4,4]Tf2N and [N1,4,4,4]Tf2N showed relatively high biocompatibility to cells. At the same time, five ionic liquids on cell membrane permeability were improved effect. Whole-cell catalysis results displayed that [Py14]Tf2N was optimal ionic liquid. When the addition of [Py14]Tf2N was 25%, after 84 h, glycyrrhetinic acid monoglucuronide(GAMG) rate and glycyrrhizin acid(GL) conversion rate were as high as 95.38% and 99.84%. Therefore, the addition of [Py14]Tf2N, greatly promoted the formation of conversion and product. It showed that the effects of five kinds of ionic liquids on cells properties of growth and metabolism, cell membrane permeability and the whole cell catalytic activity were not only related to the anion Tf2N-, but also played an important role in the composition, structure and properties of the cations.

Tf2N-; Cation; Ionic liquid;PenicilliumpurpurogenumLi-3; Glycyrrhetinic acid monoglucuronide

10.7503/cjcu20160201

2016-03-31. 網絡出版日期: 2016-09-23.

國家自然科學基金(批準號: 21146012, 21266029)資助.

O643; Q556+.2

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聯系人簡介: 曹紅, 女, 博士, 研究員, 主要從事生物催化與酶工程研究. E-mail: chyf_ch@126.com