UPLC-MS/MS法測定乳品中L-羥脯氨酸的含量

黃蓓蓓

（三門峽職業技術學院，河南三門峽472000）

UPLC-MS/MS法測定乳品中L-羥脯氨酸的含量

黃蓓蓓

（三門峽職業技術學院，河南三門峽472000）

采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）測定乳制品中L-羥脯氨酸的含量。試樣經牛蛋白酶酶解，乙腈萃取，HLB固相萃取柱凈化后，UPLC BEH C18色譜柱分離，多反應監測（MRM）模式，定量離子對（m/z）：132.1/86.2；定性離子對（m/z）：132.1/68.3。結果表明：L-羥脯氨酸加標回收率在94.53%～98.42%之間，相對標準偏差不大于7.3%；按信噪比RSN=10計算，方法定量限（LOQ）為5.0μg/kg。

超高效液相色譜-串聯質譜法；L-羥脯氨酸；乳制品；測定

動物水解蛋白是由動物皮革及其制品下腳料等水解得到的蛋白質，長期誤食，可導致關節疏松、腫大，造成重金屬中毒。2009年衛生部公布《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》中明確規定：乳及乳制品、含乳飲料中不得添加水解動物蛋白。然而部分違規企業為降低生產成本，經常會在鮮奶、奶粉等乳品中摻入動物水解蛋白，以期提高乳品中蛋白質含量，這嚴重影響了乳品加工企業產品質量，威脅消費者人身健康，尤其是嬰幼兒、孕產婦、病人等特殊人群。L-羥脯氨酸是動物水解蛋白中特征性氨基酸，約占膠原蛋白氨基酸總量的10%，而乳蛋白質中不含L-羥脯氨酸[1]。為此，L-羥脯氨酸已作為檢測乳及乳制品中是否非法摻入動物水解蛋白的重要標示物。

目前，國內外對L-羥脯氨酸的檢測方法主要有分光光度法[2]、液相色譜法[3]、氨基酸分析儀法[4]、毛細管電泳-激光誘導熒光檢測法[5]等，而這幾種方法存在樣品前處理復雜，特異性、靈敏度、準確度較差等缺點；而液相色譜-質譜法是通過液相色譜將待測樣品中的有機物分離，再利用質譜對分開的有機物逐個的分析，得到有機物分子量、結構和濃度等信息，顯著提高了檢測方法的準確度、靈敏度。但目前關于超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）測定乳制品中L-羥脯氨酸含量的相關研究較少。本文以乳制品為研究對象，探索超高效液相色譜-串聯質譜法測定乳制品中L-羥脯氨酸含量的分析方法，為乳制品行政監督部門、檢測機構、乳制品加工企業提供實際的檢測方法參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯四極桿質譜儀（Waters Acquity UPLC Quattro Premier XE）：美國沃特世公司；電子分析天平（XS-205型）：賽多利斯北京有限公司；超純水器（Milli-Q型）：美國Millipore公司；有機微孔濾膜（0.22 μm）：島津企業管理（中國）有限公司；固相萃取裝置（DG-24B型）：美國Supelco公司。

L-羥脯氨酸標準溶液（1 000 μg/mL）：準確稱取L-羥脯氨酸標準品100 mg（精確至0.1 mg），用0.01 mol/L鹽酸溶解并定容至100 mL，-4℃以下避光保存。

奶粉、酸奶、鮮奶：購自當地超市。所用試劑除特別標注外均為分析純試劑，水為超純水。L-羥脯氨酸標準物質（L-Hydroxyproline，C5H9NO3，CAS：51-35-4），純度≥99.5%：購自美國SIGMA公司；乙腈、甲醇、正己烷（色譜純）：德國默克公司；氮氣、氬氣（純度≥99.99%）：張家口市宣化燕山氣體有限公司；HLB固相萃取小柱（200 mg/3 mL）：美國Waters公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相A：乙腈；流動相B：0.1%甲酸水溶液；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of the mobile phase

1.2.2 質譜條件

電離方式：電噴霧電離，正離子模式，ESI（+）；檢測方式：多反應監測（MRM）；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣：氮氣，600 L/h，350 ℃；錐孔氣：氮氣，45 L/h；碰撞氣：氬氣；噴霧電壓：2.5 kV；定性離子對（m/z）：132.1/68.3；定量離子對（m/z）：132.1/86.2；錐孔電壓：20 V；碰撞電壓：25 V。

1.3 樣品前處理

稱取固態試樣2 g（精確至0.01 g）置于50 mL塑料離心管中，100 mmol/L甲酸銨緩沖鹽溶液5 mL，牛蛋白酶液50 μL，漩渦混合2 min，50℃下酶解3 h后，加入5 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，以10 000 r/min離心5 min，上清液用HLB小柱凈化，待自然流干后，用0.1%甲酸-乙腈4 mL清洗上述離心管，并將清洗液依次過柱，收集全部流出液體，35℃水浴氮氣吹至近干，準確加入1.0 mL乙腈-甲酸水溶液超聲2 min后再渦旋溶解，經0.22 μm微孔濾膜過濾，供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4 標準曲線繪制

稱取相同基質的空白試樣6份，每份2 g，分別加入適量的標準工作溶液，制備成含L-羥脯氨酸濃度依次為 5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg 的樣品，按 1.2 和1.3節進行操作，以特征離子色譜峰面積為縱坐標，L-羥脯氨酸標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

L-羥脯氨酸是弱酸性化合物，故采用正離子模式掃描。用乙腈將L-羥脯氨酸標準儲備液稀釋成濃度均為1.0 μg/mL的單標溶液，用蠕動泵以10 μg/mL的流速，將L-羥脯氨酸標準溶液注入質譜檢測器中，進行一級質譜掃描，得到m/z為132.1的準分子離子峰[M+H]+，優化錐孔電壓等參數使分子離子峰達到最大強度；對分子離子峰進行碰撞碎裂優化，選擇多反應監測（MRM）模式采集，離子源溫度為150℃，碰撞氣為氬氣，錐孔電壓為25 V，碰撞電壓為25 V，對分子離子進行二級質譜分析（子離子掃描），得到較多的碎片離子信息（圖1），定量離子對為m/z 132.1/86.2；定性離子對（m/z）為132.1/68.3。在上述質譜條件下，L-羥脯氨酸多反應監測色譜圖峰型對稱尖銳，峰型良好，未見明顯的干擾峰（圖2）。

2.2 UPLC色譜條件的優化

本試驗采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱分析，考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水作為流動相時，色譜圖基線、L-羥脯氨酸響應值、峰型、與干擾雜質峰的分離度等因素，試驗表明：在水溶液中加入少量甲酸有助于L-羥脯氨酸的離子化，響應值更高；乙腈-0.1%甲酸水溶液體系能較好的分離L-羥脯氨酸峰，經優化篩選獲得較佳的流動相梯度洗脫程序（表1），分離度大于1.5、基線平穩、出峰時間適中，半峰寬窄、峰型對稱尖銳（圖2），并且由于使用0.1%甲酸而抑制水相中微生物的滋生，延長了流動相使用期限。故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。

圖1 L-羥脯氨酸二級質譜掃描圖Fig.1 Two-stage scan spectra of L-Hydroxyproline

圖2 L-羥脯氨酸標準品高效液相色譜-質譜圖Fig.2 Chromatography of L-Hydroxyproline by performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

2.3 提取溶劑的選擇

不同溶劑對L-羥脯氨酸提取效果的影響見表2。

表2 不同溶劑對L-羥脯氨酸提取效果的影響（n=6）Table 2 Effects of different solvent on L-Hydroxyproline extraction（n=6）

從表2中可知：二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、環己烷等4種試劑均可提取乳制品中的L-羥脯氨酸，其中乙酸乙酯和環己烷萃取時會帶入大量脂溶性雜質和干擾峰，且無法萃取已溶于水相中的部分L-羥脯氨酸，造成L-羥脯氨酸部分提取，引起提取率不高；乙腈可提取乳制品試樣中4-HR，且雜質干擾峰較少，故本文選擇乙腈作為提取溶劑。

2.4 凈化方式的選擇

為獲得較好的凈化效果及回收率，本文考察了液液萃取、分散固相萃取、固相萃取（C18柱、中性氧化鋁柱、HLB柱、石墨化碳粉柱、氨基柱、二醇柱等）3種凈化方式對乳制品中L-羥脯氨酸含量測定的影響見表3。

表3 不同凈化方式條件下的加標回收率（n=6）Table 3 The recoveries under different purification conditions（n=6）

從表3中可知：采用分散固相萃取法與固相萃取法，L-羥脯氨酸回收率均較高，尤其是HLB固相萃取小柱凈化效果最佳，回收率高達96.7%，且雜質干擾峰少；而采用液液萃取法，L-羥脯氨酸回收率約80%左右，明顯低于采用分散固相萃取法與固相萃取法。故最終凈化方式選擇HLB固相萃取。

2.5 方法線性范圍、檢出限和定量限

稱取基質相同的空白試樣6份，每份2 g，分別加入適量的標準工作液，制備成L-羥脯氨酸終濃度依次為 5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg 的待測樣，按 1.2 和1.3節進行測定（表4）。

表4 線性方程、相關系數、檢出限和定量限（n=6）Table 4 Linear equation，correlation coefficient，the detection limit and quantitation limit（n=6）

從表4中可知：在不同乳制品中L-羥脯氨酸在5.0 μg/kg～100.0 μg/kg 范圍內，線性關系良好，相關系數（R2）在 0.998 6～0.999 7之間；按信噪比 RSN＝ 10計算，方法定量限（LOQ）為5.0 μg/kg，滿足國內乳制品中L-羥脯氨酸限量的檢測要求。

在乳制品中依次添加終濃度為5.0、10.0、50.0 μg/kg的L-羥脯氨酸，每個水平設6個平行，L-羥脯氨酸的加標回收率及相對標準偏差見表5。

從表5中可知：在3種乳制品基質中，敵百蟲的平均加標回收率為94.53%～98.42%，精密度（相對標準偏差，RSD）為 3.7% ～7.3%。

表5 回收率和精密度（n=6）Table 5 Recovery and precision（n=6）

2.6 實際樣品的測定

隨機選取30份市售乳制品，采用本文所建立的超高效液相色譜-串聯質譜法法測定乳制品中L-羥脯氨酸的含量。檢測結果表明：30份乳制品中，L-羥脯氨酸的含量有所差異，檢出率為6.7%，即2個樣品中檢測出含有L-羥脯氨酸的成份，可判定這2個廠家可能在乳制品中摻入廉價的水解動物蛋白來冒充或替代乳蛋白質，以提高乳制品中蛋白的質量分數，從而降低成本；而這些摻入的水解動物蛋白可能會影響乳制品風味和口感，且因L-羥脯氨酸不易消化，造成營養價值降低，導致人體吸收利用率下降，影響消費者的人身健康安全。因此，為了確保乳制品質量安全和維護消費者權益，相關行政部門有必要加強對乳制品中L-羥脯氨酸行政監督與日常監測。

3 結論

動物水解蛋白是由動物皮革及其制品下腳料等水解得到的蛋白質，長期誤食，可導致關節疏松、腫大，造成重金屬中毒，目前L-羥脯氨酸已作為檢測乳及乳制品中是否非法摻入動物水解蛋白的重要標示物。本文采用超高效液相色譜-串聯質譜法，將試樣經牛蛋白酶酶解，乙腈萃取，HLB固相萃取柱凈化后，UPLC BEH C18色譜柱分離，多反應監測（MRM）模式，定量離子對（m/z）：132.1/86.2；定性離子對（m/z）：132.1/68.3。結果表明：L-羥脯氨酸加標回收率在94.53%～98.42%之間，相對標準偏差不大于7.3%；按信噪比RSN＝10計算，方法定量限（LOQ）為5.0 μg/kg。該方法準確度高、靈敏度好、穩定性強，將為乳制品行政監督部門、第三方檢測機構、乳制品加工企業提供實際的檢測方法指導。

[1] 李景紅,孟祥晨.高效液相色譜法檢測牛乳中摻加的膠原水解蛋白[J].中國乳品工業,2008,36(11)：56-59

[2] 趙天珍,袁秀金,譚貴良,等.比色法快速測定奶粉和含乳飲料中游離L-羥脯氨酸[J].食品研究與開發,2008,29(12)：111-113

[3] 胡華,呂定,杜青,等.高效液相色譜法檢測醬油中羥脯氨酸的含量[J].中國調味品,2010,35(4)：106-109

[4] Peter Bohlen,Michel Mellet.Automated fluorometric amino acid analysis：The determination of proline and hydroxyproline[J].Analytical Biochemistry,1979,94(2)：313-321

[5] 鄒曉莉,周春艷,黎源倩.毛細管電泳-激光誘導熒光檢測肌腱和肌腱細胞中的羥脯氨酸[J].分析化學,2006,34(10)：1441-1444

Determination of L-Hydroxyproline in Dairy Products by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HUANG Bei-bei
（Sanmenxia Polytechnic，Sanmenxia 472000，Henan，China）

A method for determining the residues of L-Hydroxyproline in dairy products was established by an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Samples was enzymatic digest of bovine，and ultrasonic extracted with ethyl acetate，and purified with HLB solid phase extraction cartridge，and separated by UPLC BEH C18column，and quantitative analysis was performed by the multi-reaction-monitoring（MRM）mode.The qualitative ion pair （m/z）was 132.1/86.2；the quantitative ion pair （m/z）was 132.1/68.3.The results showed that the recoveries were between 94.53%-98.42%，and the relative standard deviation were less than 7.3%；according to RSN=10，the limit of quantificationn was 5.0 μg/kg.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry；L-Hydroxyproline；dairy products；determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.032

黃蓓蓓（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品分析與發酵工程。

2016-02-18