多配體蛋白聚糖結合蛋白在女性腦膠質瘤侵襲/轉移中的異常表達機制及其影像學規律

周秀云

(北京市海淀區婦幼保健院超聲科，北京　100080)

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·腫瘤·

多配體蛋白聚糖結合蛋白在女性腦膠質瘤侵襲/轉移中的異常表達機制及其影像學規律

周秀云

(北京市海淀區婦幼保健院超聲科，北京100080)

目的探討多配體蛋白聚糖結合蛋白(Syntenin)在女性腦膠質瘤侵襲/轉移中的異常表達分子機制并分析其影像學規律。方法選取45例該院收治的經手術證實的女性腦腫瘤患者，其中腦膠質瘤26例，轉移瘤19例。取手術切除獲得的26份腦膠質瘤組織，采用RT-PCR和免疫印跡技術檢測Syntenin和磷酸化FAK Tyr397基因與蛋白的表達情況。收集術前患者行常規MRI和動態增強MRI掃描相關資料，在腫瘤實性區域最大截面和周圍區域分別選取3個ROI，經工作站處理并計算得到ROI內的腫瘤的容積轉運常數(Ktrans)、回流速率常數(Kep)、血管外細胞容積分數(Ve)。分析腦膠質瘤和轉移瘤的影像學規律。結果Syntenin mRNA、FAK mRNA表達水平在不同病理分級的腦膠質瘤中差異均有統計學意義(P<0.05)；Syntenin mRNA、FAK mRNA表達水平與腦膠質瘤病理等級呈正相關。Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達水平在不同病理分級的腦膠質瘤中差異均有統計學意義(P<0.05)；Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達水平與腦膠質瘤病理等級呈正相關；Syntenin 蛋白表達水平與FAK Tyr397呈正相關。膠質瘤與轉移瘤的瘤實質Ktrans、Kep、Ve值之間差異均無統計學意義(P>0.05)。膠角質母細胞瘤周圍區域Ktrans、Kep、Ve值均明顯高于轉移瘤周圍區域，差異有統計學意義(P<0.05)。膠質瘤Ktrans值與周圍區域Ktrans、Kep、Ve值均呈正相關；腦轉移瘤Ktrans值與周圍區域Ktrans、Kep、Ve值均無相關性。結論女性腦膠質瘤中Syntenin可通過與FAK相互作用經相應的信號通路提升腫瘤細胞的侵襲和轉移能力；動態增強MRI可準確反映腦膠質瘤和腦轉移瘤實性部分和瘤周區域的血腦屏障損壞程度，在兩者鑒別診斷中具有重要價值。

腦膠質瘤；多配體蛋白聚糖結合蛋白；黏著斑激酶；腦轉移瘤

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，具有惡性生長、侵襲性強、預后不佳等特點，其中膠質瘤高度侵襲性和轉移性是復發和病死的主要原因。多配體蛋白聚糖結合蛋白(Syntenin)是從人黑色素瘤細胞中克隆出來的一種支架蛋白，可通過上調自身PDZ結構域上黏著斑激酶(FAK)活性來介導多種腫瘤侵襲和轉移〔1〕。而Syntenin能否通過與FAK相互作用來影響腦膠質瘤的侵襲、遷移仍未明確〔2〕。本研究探討Syntenin促進腦膠質瘤侵襲、轉移的分子機制，并分析其中腦膠質瘤和轉移瘤的動態增強MRI參數特點。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2015年3月至2016年3月在本院進行 MRI 檢查，并經手術證實的腦腫瘤患者45例，均為女性。其中膠質瘤26例，年齡56～72〔平均(63.40±8.95)〕歲；膠質瘤Ⅰ級4例、Ⅱ級9例、Ⅲ級7例、Ⅳ級6例。腦轉移瘤19例(原發部位為卵巢、乳腺、肺)，年齡58～79〔平均(65.11±9.27)〕歲。入選患者均為首次手術治療，無化療史，術前均行常規MRI和DCE-MRI掃描，自愿參與本次研究。腦膠質瘤組織由膠質瘤患者手術切除獲得，經生理鹽水洗凈后，液氮速凍15 s，-80℃保存備用。

1.2主要試劑兔抗人Syntenin、FAK Tyr397多克隆抗體(上海豐壽生物科技有限公司)，小鼠抗人β-actin單克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司)，RIPA裂解液(西安晶彩生物科技有限公司)，Trizol、PCR試劑盒(上海浩然生物技術有限公司)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3膠質瘤組織中Syntenin mRNA、FAK mRNA檢測采用RT-PCR技術檢測，取100 mg腦膠質瘤組織標本，Trizol一步法提取總RNA，紫紫外分光光度法測定其純度和含量，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。-20℃保存備用。反應體系30 μl，包括：蒸餾水16 μl，緩沖液5 μl，dNTPs(2 mmol/L)3 μl，MgSO4(30 mmol/L)3 μl，引物(10 mmol/L)1 μl，cDNA 1 μl，PCR酶1 μl；采用常規兩步法，共完成30個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。取3 μl PCR擴增產行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光成像，讀取積分光密度值，以 β-actin 為內參進行校正。

1.4膠質瘤組織中Syntenin、磷酸化FAK Tyr397蛋白檢測采用Western印跡法檢測，取腦轉移瘤組織標本0.05 g，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后剪碎，加入蛋白裂解液，研磨。取組織懸液置于EP管中，4℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清，測定蛋白濃度。取蛋白樣品于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離后，轉至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封閉后分別于兔抗人Syntenin、磷酸化FAK Tyr397抗體結合，4℃放于搖床孵育4 h；Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗后與二抗結合，4℃放于搖床孵育2 h；TBST洗滌后化學增強發光法(ECL)避光孵育，發光顯示。

1.5MRI檢查35例患者均使用美國GE3.0T MRI掃描儀和八通道相控陣線圈進行掃描。數據導入GE ADW3.1影像工作站，使用Image Tool進行圖像處理，利用血流動力學雙室模型，建立動脈輸入函數(AIF)選取側腦室體層面的上矢狀竇為參照血管，標記ROI面積約為50 mm2，得到時間-對比劑濃度曲線。取腫瘤實性最大截面部分測量3個ROI，參考常規MRI掃描，避開出血、壞死、鈣化、囊性病變區域，計算得到腫瘤的容積轉運常數(Ktrans)、回流速率常數(Kep)、血管外細胞容積分數(Ve)，記錄3個ROI中的上述變量值，計算平均值。

1.6統計學方法應用SPSS11.0軟件行t檢驗和Pearson等級相關性分析。

2　結　果

2.1膠質瘤組織中Syntenin mRNA、FAK mRNA的表達情況不同病理分級腦的腦膠質瘤中，Syntenin mRNA/β-actin mRNA的光密度比值分別為：Ⅰ級0.00±0.00、Ⅱ級0.40±0.02、Ⅲ級0.71±0.02、Ⅳ級0.94±0.01；FAK mRNA /β-actin mRNA的光密度比值分別為：Ⅰ級0.90±0.01、Ⅱ級1.16±0.09、Ⅲ級1.42±0.04、Ⅳ級1.89±0.04。Syntenin mRNA、FAK mRNA表達水平在不同病理分級的腦膠質瘤中差異均有統計學意義(P<0.05)。Pearson分析顯示，Syntenin mRNA、FAK mRNA表達水平與腦膠質瘤病理等級呈正相關(r=0.891、0.963，P<0.05)。見圖1。

2.2膠質瘤組織中Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達情況不同病理分級腦的腦膠質瘤中Syntenin條帶與β-actin條帶的灰度值比值分別為：Ⅰ級0.00±0.00、Ⅱ級0.20±0.05、Ⅲ級0.39±0.03、Ⅳ級0.90±0.03；磷酸化FAK Tyr397比值分別為：Ⅰ級0.19±0.02、Ⅱ級0.30±0.02、Ⅲ級0.50±0.01、Ⅳ級0.76±0.05。Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達水平在不同病理分級的腦膠質瘤中均有統計學差異(P<0.05)。Pearson分析顯示，Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達水平與腦膠質瘤病理等級呈正相關(r=0.962、0.947，P<0.05)。Syntenin 蛋白表達水平與FAK Tyr397呈正相關(r=0.935，P<0.05)。見圖2。

2.3膠質瘤與轉移瘤影像學測量參數比較膠質瘤與轉移瘤的瘤實質Ktrans、Kep、Ve值之間均無統計學差異(P>0.05)。膠角質母細胞瘤周圍區域Ktrans、Kep、Ve值均明顯高于轉移瘤周圍區域(P<0.05)。見表1。

圖1　不同病理分級腦膠質瘤中Syntenin mRNA、FAK mRNA表達變化

圖2　不同病理分級腦膠質瘤中Syntenin 與磷酸化FAK Tyr397蛋白表達變化

類型n Ktrans 瘤實質瘤周圍 Kep 瘤實質瘤周圍 Ve 瘤實質瘤周圍膠質瘤260.26±0.070.09±0.041)0.40±0.090.42±0.091)0.64±0.100.11±0.031)轉移瘤190.24±0.060.04±0.020.36±0.050.21±0.050.68±0.120.07±0.02

與轉移瘤相比：1)P<0.05

2.4瘤實質Ktrans值與其周圍區域Ktrans、Kep、Ve值相關性分析膠質瘤Ktrans值與周圍區域Ktrans、Kep、Ve值均呈正相關(r=0.762、0.475、0.662，P<0.05)。腦轉移瘤Ktrans值與周圍區域Ktrans、Kep、Ve值均無相關性(r=0.251、0.030、0.105，P>0.05)。

3　討　論

Syntenin是包含2個PDZ結構域的支架蛋白，在多種惡性腫瘤細胞系中均呈過度表達，并且與腫瘤惡性程度及病情進展緊密相連。研究發現，腦膠質瘤組織中Syntenin表達水平隨組織惡性程度的增加而上升〔3〕。分子機制研究顯示，Syntenin通過上調FAK活性來介導黑色素瘤轉移〔4〕，而Syntenin能否通過與FAK相互作用來影響腦膠質瘤的侵襲、遷移，目前仍未明確。

本研究提示腦膠質瘤細胞中Syntenin可通過與FAK相互作用，通過對應的信號通路來調控細胞結構重組、黏著斑形成、降解等過程，促進腦膠質瘤細胞的轉移和侵襲〔5〕。相關研究顯示，FAK的C末端仍未發現和PDZ結構域相結合的基因序列〔6〕，說明黏著斑中Syntenin和FAK的相互作用還需要其他分子介導。本次研究說明在腦膠質瘤中，Syntenin能夠通過提升整合素介導的FAK信號通路來促進腦膠質瘤細胞的轉移和侵襲。

動態增強MRI可通過追蹤對比劑來評估血腦屏障結構完整性和腦中血流動力學，分為定量和半定量參數分析，半定量參數主要反映腫瘤組織中的灌注情況，定量參數可分析腫瘤的血管通透性，包括Ktrans、Kep、Ve值，其關系可用Ve=Ktrans/Kep表示，數值越高說明血管通透性越強〔7〕。本次研究提示腦膠質瘤和腦轉移瘤破壞血腦屏障方面無明顯差異，說明上述腫瘤具有類似的惡性腫瘤特性。

瘤周區域包括腫瘤浸潤區、腫瘤組織周圍水腫區。本次研究說明腦膠質瘤周區域的血管通透性增加，血腦屏障損壞程度明顯高于腦轉移瘤。腦膠質瘤中有明顯的血管增生，對周圍組織有較強浸潤性，瘤周微循環出現異常，主要與其內生皮細胞間距增寬，由血管通透性增加引發。腦轉移瘤周區域無腫瘤細胞，Ktrans、Kep、Ve值相對較低。本次研究結果和腫瘤自身特征相吻合，腦膠質瘤和轉移瘤的瘤周區域的微血管通透性存在明顯差異，對這其鑒別診斷具有重要價值。

1Kegelman TP,Das SK，Emdad L,etal.Targeting tumor invasion:the roles of MDA-9/Syntenin〔J〕.Expert Opin Ther Target，2015；19(1):97-112.

2晉暉.氫質子磁共振波譜在腦膠質瘤臨床應用中的價值〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(7):1815-6.

3Hwangbo C，Park J，Lee JH，etal.mda-9/Syntenin protein positively regulates the activation of Akt protein by facilitating integrin-linked kinase adaptor function during adhesion to type I collagen〔J〕.J Biol Chem，2011；286(38):33601-12.

4Sala-Valdés M，Gordón-Alonso M，Tejera E，etal.Association of syntenin-1 with M-RIP polarizes Rac-1 activation during chemotaxis and immune interactions〔J〕.J Cell Sci，2012；125(5):1235-46.

5Das SK，Bhutia SK，Kegelman TP，etal.MDA-9/syntenin:a positive gatekeeper of melanoma metastasis〔J〕.Front Biosci，2012；17(1):1-15.

6Kegelman TP，Das SK，Hu B,etal.MDA-9/syntenin is a key regulator of glioma pathogenesis〔J〕.Neurol Oncol，2014；16(1):50-61.

7李永麗，連建敏，竇社偉，等.腦膠質瘤術后放療后復發和放射性腦壞死磁共振彌散張量成像鑒別〔J〕.鄭州大學學報(醫學版)，2013；48(3):362-5.

〔2015-12-11修回〕

(編輯袁左鳴)

北京市自然科學基金重大項目(20147110001)；北京市海淀區科技發展計劃項目(K20110069)

周秀云(1964-)，女，副主任醫師，主要從事超聲影像學診斷研究。

R65

A

1005-9202(2016)18-4496-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.045