速效燒傷膏質(zhì)量標準研究

葉玉華

（湖南省邵陽市食品藥品檢驗所，湖南邵陽422000）

速效燒傷膏質(zhì)量標準研究

葉玉華

（湖南省邵陽市食品藥品檢驗所，湖南邵陽422000）

目的建立速效燒傷膏的質(zhì)量標準。方法采用薄層色譜（TLC）法對方中大黃和黃柏進行定性鑒別；采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃柏中鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果薄層色譜圖斑點清晰，陰性對照無干擾。鹽酸小檗堿進樣量在0.100 6～2.515 0*g范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，r=0.999 2（n=6）；平均回收率為94.99%，RSD=1.40%（n=9）。結(jié)論該方法簡便可行，專屬性強，靈敏度高，重復性好，可用于速效燒傷膏的質(zhì)量控制。

速效燒傷膏；薄層色譜法；鹽酸小檗堿；高效液相色譜法

速效燒傷膏為湖南省武岡市中醫(yī)院制劑，主要由大黃、黃柏、紅花、延胡索等7味中藥組方，是在傳統(tǒng)名醫(yī)驗方的基礎(chǔ)上，運用現(xiàn)代藥效學理論精心研制而成，具有清熱解毒、化瘀生肌等功效，主治燒傷、燙傷等疾病。該制劑在臨床應用多年，療效確切，但由于為傳統(tǒng)驗方，其質(zhì)量標準只有性狀、軟膏劑的通項檢驗和微生物限度檢查，過于簡單，不能有效地控制速效燒傷膏的質(zhì)量。為對速效燒傷膏的質(zhì)量進行有效控制，本研究中根據(jù)處方組成、各藥材的投料量及制備工藝進行分析，制劑中的君藥為黃柏，臣藥為大黃，故對制劑中的黃柏和大黃分別進行了薄層色譜（TLC）定性試驗，且經(jīng)多次試驗證明，薄層色譜定性專屬性強，簡便快速，且其他藥材對該試驗均無干擾，能很好地控制上述2味藥材的質(zhì)量。為進一步以量化的指標來控制本制劑中的君藥，對黃柏中的有效成分鹽酸小檗堿用高效液相色譜（HPLC）法進行含量分析，用含量測定的數(shù)據(jù)來精確控制黃柏藥材質(zhì)量和投料量，并進一步驗證該制劑的制備工藝是否穩(wěn)定成熟?，F(xiàn)報道如下。

圖1　黃柏薄層色譜圖

1　儀器與試藥

1.1儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB204-N型電子天平（梅特勒-托列多儀器＜上海＞有限公司），AUW220型電子天平（日本島津公司）。

1.2試藥

黃柏對照藥材（批號為120937-201007）、大黃對照藥材（批號為120909-200905）、鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201212）均由中國食品藥品檢定研究院提供；速效燒傷膏（湖南省武岡市中醫(yī)院，自制）；水為重蒸餾水；乙腈（美國天地試劑有限公司，批號為12020466）為色譜純；乙酸乙酯（天津市永大化學試劑有限公司，批號為20130116）、甲醇（天津市永大化學試劑有限公司，批號為20130508）及其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1黃柏［1］

取樣品20 g內(nèi)容物，加入50 mL稀鹽酸和80 mL乙酸乙酯，經(jīng)過30 min水浴加熱回流，靜置冷卻并分層；取酸水層，用氨水將pH調(diào)至9～10；加入三氯甲烷30 mL，萃取2次；合并三氯甲烷液并蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL，使其溶解，作為供試品溶液。取20 g速效燒傷膏缺黃柏的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，并以苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-氨水（12∶6∶3∶3∶1）為展開劑，放置在用氨蒸氣飽和的展開槽中預飽和30 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜峰相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照品溶液色譜則無此斑點。結(jié)果見圖1。

2.1.2大黃［2］

取樣品20 g內(nèi)容物，加入40 mL甲醇，用超聲儀處理15 min，濾過，濾液蒸干；在殘渣中加水20 mL，使其溶解；再加入鹽酸1 mL，經(jīng)30 min水浴加熱回流，靜置冷卻；加入乙醚20 mL，振搖提取2次；合并乙醚液并自然揮干，殘渣加三氯甲烷1 mL，使其溶解，作為供試品溶液。取20 g速效燒傷膏缺大黃的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。取0.1 g大黃對照藥材，同法制成對照藥材溶液。另取大黃酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜峰相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，置氨蒸氣中熏后，斑點變?yōu)榧t色，且陰性對照品溶液則無此斑點。結(jié)果見圖2。

圖2　大黃薄層色譜圖

2.2鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1色譜條件［3］

色譜柱：HypersilGOLDXB-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50），每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g；檢測波長：265 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2.2溶液制備

對照品溶液：取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.100 6 g/L的對照品溶液。

供試品溶液：精密稱取樣品10 g，加稀鹽酸25 mL和乙酸乙酯50 mL，加熱回流30 min，靜置冷卻并分層；取酸水層用氨水將pH調(diào)至9～10，加入三氯甲烷25 mL，振搖提取3次；合并三氯甲烷液并水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按制備工藝，制備缺黃柏的陰性樣品；按供試品溶液制備方法，制成缺黃柏的陰性對照品溶液。

2.2.3方法學考察

專屬性試驗：精密吸取陰性對照品溶液、對照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定。結(jié)果各色譜峰均達基線分離且峰形良好；理論板數(shù)均在4 000以上。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜峰相應的位置上檢出色譜峰，陰性對照品溶液色譜中未檢出相應色譜峰，說明陰性樣品無干擾，見圖3。

線性關(guān)系考察：精密吸取質(zhì)量濃度為0.100 6 g/L的鹽酸小檗堿對照品溶液1，5，10，15，20，25 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定峰面積，以進樣量（C）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程A=36 356×106C-4.005 3×104，r= 0.9992（n=6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進樣量在0.1006～2.515 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取同一質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液連續(xù)進樣5次，測定峰面積。結(jié)果其平均值為1573235，RSD為0.28%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0，1，2，4，8，16，24 h時進樣，測定鹽酸小檗堿峰面積。結(jié)果其平均值為1 568 594，RSD為0.49%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：按擬訂含量測定方法，取同一批號（武岡市中醫(yī)院制備，批號為20130801）樣品5份，重復測定其鹽酸小檗堿含量。結(jié)果其平均含量為0.640 2 mg/g，RSD為0.37%（n=5），表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：分別精密吸取已知含量的供試品（武岡市中醫(yī)院制備，批號為20130801，含量為0.6402mg/g）4，5，6 g各3份，共9份，各精密加入對照品溶液（0.301 2 g/L）8.0，8.0，8.0，10.0，10.0，10.0，12.0，12.0，12.0 mL，加稀鹽酸和乙酸乙酯各25 mL，按2.2.2項下供試品溶液制備方法操作，按擬訂色譜條件進樣測定鹽酸小檗堿含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

圖3　高效液相色譜圖

2.2.4樣品含量測定

按擬訂方法測定3批樣品中鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表2。

3　討論

3.1定性鑒別

黃柏有清熱燥濕、解毒療瘡的功效，大黃有清熱瀉火、涼血解毒的功效，故兩者均被應用于速效燒傷膏，用于治療燒傷、燙傷。為保證制劑的療效，故對黃柏、大黃進行了薄層色譜鑒別。薄層色譜鑒別法在中成藥及中藥材質(zhì)量控制中是一種操作簡單、快速準確的方法，在《中國藥典》和各種藥品標準中均被廣泛使用。本研究中參照2010年版《中國藥典（一部）》提取方法及薄層層析條件分別對黃柏、大黃建立了薄層色譜鑒別方法。

由于該制劑為軟膏劑，基質(zhì)中含大量的蜂蠟和麻油，用甲醇直接提取，帶入雜質(zhì)太多，薄層色譜結(jié)果不理想。為除去基質(zhì)干擾，本試驗中分別用乙醚、乙酸乙酯、乙醇對基質(zhì)進行溶解性試驗，結(jié)果用乙酸乙酯加熱回流能溶解大部分的基質(zhì)。因大黃的有效成分在甲醇中易溶，故同時在樣品中加入甲醇和乙酸乙酯溶劑，加熱回流提取后，靜置后2種溶劑可分層。這樣在消除基質(zhì)干擾的同時又能提取大黃的有效成分，且操作簡單、省時。用甲醇加熱回流提取得到的是大黃粗品，為保證大黃的薄層色譜圖主斑點清晰，需對其進行精制處理。本研究中對大黃粗品酸水解后用乙醚萃取，進行薄層色譜鑒別，色譜圖效果良好，且陰性樣品也未見干擾。

表1　鹽酸小檗堿加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

表2　樣品含量測定結(jié)果

根據(jù)中藥市場大黃目前的質(zhì)量狀況，大黃的偽品土大黃易被誤作大黃投料使用，故本試驗中用大黃對照藥材進行薄層色譜定性鑒別。并分別通過用氨氣熏顯色和在紫外光燈下（365 nm）2種檢視方法進行檢測，有效地控制了大黃原藥材的質(zhì)量。由于黃柏為該處方中的君藥，有效成分為小檗堿類生物堿，故根據(jù)本處方工藝，經(jīng)反復試驗，對鹽酸小檗堿采用酸溶堿沉的方法取凈后，再進行薄層色譜鑒別。結(jié)果各斑點分離效果好，圖譜清晰，陰性樣品也未見干擾。黃柏藥材在2010年版《中國藥典（一部）》分別被列為黃柏與關(guān)黃柏2個品種，其來源不同，主成分鹽酸小檗堿的含量也相差較大。本處方中明確投入黃柏，為防止以關(guān)黃柏充黃柏用，特制訂了鹽酸小檗堿的含量測定方法。其他藥材如延胡索、紅花及穿心蓮在該處方中用量較小，均為佐、使藥，也分別對其進行了薄層色譜鑒別摸索。由于用量不大，有效成分不能被完全提出，薄層色譜圖不理想，甚至有的陰性樣品有干擾，故未列入質(zhì)量標準中。

3.2定量鑒別

樣品加稀鹽酸和乙酸乙酯回流時間考察：分別回流15，30，60 min，結(jié)果表明，15 min太短，有效成分未完全提取出來；60 min時間太長，有效成分的提取率與30 min相當。故選擇加熱回流30 min提取方法。

黃柏來源于蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮，為該制劑處方的君藥，其主要有效成分為鹽酸小檗堿，故選擇鹽酸小檗堿作為含量測定指標。參照2010年版《中國藥典（一部）》黃柏含量測定項下的方法要求，用HPLC法測定該樣品中的鹽酸小檗堿含量。試驗結(jié)果表明，鹽酸小檗堿色譜峰與相鄰色譜峰的分離效果良好，各項方法學考察指標較好，方法可行。

用三氯甲烷振搖提取次數(shù)考察：分別比較三氯甲烷振搖提取1，3，5次的效果，結(jié)果表明，3次即可提取完全。

流動相選擇：試用乙腈-水（40∶60，每1 000 mL流動相中含磷酸二氫鉀3.5 g，十二烷基磺酸鈉1.5 g）［4］、乙腈-0.1%磷酸溶液（45∶55，每100 mL加十二烷基硫酸鈉0.2 g）［5］、0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈（60∶40）［6］、乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g），經(jīng)試驗，只有以乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g）為流動相時，鹽酸小檗堿的色譜峰與相鄰色譜峰才能達到有效分離，且峰形良好。

流速選擇：分別將流動相的流速設(shè)置為0.8，1.0，1.2 mL/min，色譜峰無明顯改善，故選用常規(guī)流速1.0 mL/min對樣品進行測定。

色譜柱選擇：分別采用Hypersil GOLD XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）、Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析樣品，結(jié)果用Hypersil GOLD XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）時，樣品的色譜峰理論板數(shù)、保留時間及分離度均達到藥典要求。

柱溫選擇：將柱溫分別設(shè)為30，35，40℃，結(jié)果色譜峰的保留時間、峰形及分離度在柱溫為35℃時均比較滿意。

檢測波長確定：取鹽酸小檗堿對照品溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描測定［7］，結(jié)果在263nm及348nm波長處均有最大吸收，但348nm更接近紫外區(qū)的邊緣，易受其他雜質(zhì)干擾。故選用了2010年版《中國藥典（一部）》方法中的265 nm為其檢測波長。

3.3方法評估

該方法專屬性強、重復性好、精密度高、回收率好，可作為速效燒傷膏的質(zhì)量控制方法。

［1］苗明三，李振國.現(xiàn)代實用中藥質(zhì)量控制技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：921.

［2］孫文基，謝世昌.天然藥物成分定量分析［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2003：355.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：286.

［4］許曉鋒，譚永恒，劉鑒洪.HPLC法測定婦炎消洗劑中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18（4）：320-322.

［5］李翔，劉皈陽，馬建麗，等.HPLC法測定梔子黃柏口服液中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的含量［J］.中國藥師，2013，16（8）：1 180-1 182.

［6］湯小燕，陳越，李炯.HPLC法測定連柏燒傷膏中小檗堿［J］.今日藥學，2013（11）：102-104.

［7］溫堅，李芳，林三清，等.紫外分光光度法測定三消丹膠囊中鹽酸小檗堿的含量［J］.中國藥師，2009，12（5）：589-590.

Quality Standard for Suxiao Shaoshang Ointment

Ye Yuhua
（Shaoyang Institute for Food and Drug Control，Shaoyang，Hunan，China 422000）

ObjectiveTo establish the quality control standard of Suxiao Shaoshang Ointment.MethodsThe qualitative identification of Radix et Rhizoma Rhei and Cortex phellodendri chinensis were done by TLC，the content of berberine hydrochloride was determined by HPLC.ResultsTheRadix et Rhizoma Rhei andCortex phellodendri chinensis could be identified by TLC，the TLC spots developed were fairly clear；the linear range of Berberine hydrochloride was 0.100 6-2.515 0 μg，r=0.999 2（n=6）；the average recovery rate was 94.99%，RSD%=1.40%（n=9）.ConclusionThe method is simple，accurate，high sensitive and good reproducible，and can be used for the quality control of Suxiao Shaoshang Ointment.

Suxiao Shaoshang Ointment；TLC；berberine hydrochloride；HPLC

R284．1；R286．0

A

1006－4931（2016）14－0044－05

葉玉華（1976-），女，副主任藥師，主要從事中藥材及中成藥檢驗工作，（電子信箱）1005613544@ qq.com。

2016－01－06；

2016－02－12）