注射填充β-磷酸三鈣生物陶瓷透明質酸混懸液的實驗研究

劉慶陽，盧建熙，周智華，郭新雯，潘舒亞，李　平，姚宸維（.上海仁愛醫院美容外科 上海 005；.上海貝奧路生物材料有限公司 上海 04；.上海市第一人民醫院 上海 00080）

·基礎研究·

注射填充β-磷酸三鈣生物陶瓷透明質酸混懸液的實驗研究

劉慶陽1，盧建熙2，周智華3，郭新雯1，潘舒亞1，李平1，姚宸維2
（1.上海仁愛醫院美容外科 上海 200235；2.上海貝奧路生物材料有限公司 上海 201114；3.上海市第一人民醫院 上海 200080）

目的：通過β-磷酸三鈣生物陶瓷與透明質酸混合后形成穩定的混懸液進行注射填充，初步了解其在兔體內的組織反應、有無刺激增生及其誘導骨生成的可能性。方法：按預先設計制成2 種不同比例的混懸液（β-磷酸三鈣生物陶瓷與透明質酸的比例分別為3∶17、3∶12），分別標記為A、B，對照組為生理鹽水。12只新西蘭大白兔隨機分成3組，在三組白兔背部上下區域進行注射，按組別隨機注射。注射后分別于第2、4、12 周提取標本，行相應觀察。結果：混懸液注射區未見明顯排異反應，皮膚無紅腫，無滲出，對照組未見明顯異常反應，1～12 周的β-磷酸三鈣生物陶瓷與周圍組織結合逐漸緊密，周圍組織細胞形態典型，細胞分布致密，未見明顯異常。材料周圍未見明顯的纖維包膜形成，未見骨形態發生蛋白2（BMP2）陽性反應。結論：β-磷酸三鈣生物陶瓷透明質酸混懸液有良好的組織相容性，無刺激性，吸收慢、不會在軟組織出現成骨現象，可通過注射方式進行填充治療，有望成為一種新型的注射性填充劑應用于整形美容領域。

β-磷酸三鈣生物陶瓷；透明質酸；注射；組織填充劑；骨形態發生蛋白2

β-磷酸三鈣生物陶瓷是一種骨填充材料，主要應用在骨科、口腔、整形等領域。研究表明，β-磷酸三鈣具有良好的生物相容性，無細胞毒性和排斥反應，有良好的誘導成骨能力，持續時間長，并能夠在體內獲得完全降解［1-3］。目前其多用于手術時進行填塞植骨，無法通過微創方法注入體內達到填充效果。透明質酸作為軟組織填充劑已經應用于臨床，效果良好，但其持續時間短，一直是影響其臨床療效的主要因素［4-6］。能否將兩種材料混合一起，形成可注射的混懸液進行注射填充，利用β-磷酸三鈣的長代謝時間來達到相對時間較長的填充效果，目前還沒有見到相關報道。另觀察β-磷酸三鈣的誘導成骨情況，可能為以后臨床骨性結構的缺損，凹陷甚至發育不足（如小頦畸形）導致的畸形通過注射方法達到骨性修補提供可能幫助。

1　材料和方法

1.1實驗材料：β-磷酸三鈣生物陶瓷購自上海貝奧路生物材料有限公司，粒徑為300～500μm，純度為95%，透明質酸購自山東華熙生物科技有限公司，濃度為17mg/ml；以上兩種產品均為無菌包裝，在無菌操作下將β-磷酸三鈣生物陶瓷與透明質酸按照2種不同的比例（3∶17、3∶12）混合，并在振蕩器上混勻形成混懸液，分別標記為A、B，另有一組無菌生理鹽水C。

1.2方法：新西蘭大白兔18只（常州卡文斯），平均體重約4.5kg。隨機分成3組，每組6只，3%戊巴比妥鈉1ml/kg兔耳緣靜脈注射麻醉，背部剃毛，消毒鋪巾［7］。三組兔背部上下兩個區域用20ml 注射器注射混懸液，每點注射2ml注入到皮下層，形成圓形隆起并標記，對照組注射生理鹽水。因混懸液中β-磷酸三鈣生物陶瓷顆粒較大，均采用16G注射針頭進行注射，注射后為防止混懸液漏出，進行縫合（圖1）。

1.3觀察指標

1.3.1外觀:觀察兔背部注射區皮膚外觀有無紅腫等變化，進行皮膚隆起區直徑大小的測量并記錄變化。

1.3.2組織學觀察：在第2、4、12 周三個節點每組提取部分注射組織，進行組織切片，分別行HE染色及bmp2免疫組化染色。

2　結果

2.1混懸液的性狀：A、B兩種混懸液均具有良好的流動性，適合通過注射器進行推注，其顆粒大小適用于20ml注射器并16G針頭進行注射（圖2）。

2.2大體觀察：注射1d后兔活動正常，注射兩組大白兔背部注射部位的皮膚隆起，無異常表現，對照組皮膚隆起消失，已經正常；2周時，混懸液包塊與皮膚之間的連接不夠緊密，有晃動現象；A、B兩組注射隆起范圍有不同程度減少，皮膚正常，無紅腫及等炎性反應，對照組已經一切正常；4周時，發現混懸液包塊與皮膚之間的連接較為緊密，無明顯晃動現象，注射隆起范圍進一步減小，A、B組無明顯差異；各組注射部位的皮膚無明顯炎癥反應；12 周時，發現混懸液包塊與皮膚之間的連接緊密，無晃動現象；A、B組大白兔注射隆起范圍進一步減少，皮膚稍有隆起，觸之柔軟。

2.3局部測量注射部位的直徑大小變化：局部注射后直徑變化，注射后當時A組局部形成腫塊的直徑平均值為：62.04mm；2周后直徑平均值為：47.05mm；1個月直徑平均值：42.40mm；3個月直徑平均值：34.33mm。注射后兩周平均吸收24.16%；注射后1個月平均吸收32.24%；注射后3個月平均吸收44.66%。B組注射當時直徑平均值為：61.34mm；2周后直徑平均值為：45.08mm；1個月直徑平均值：41.60mm；3個月直徑平均值：35.46mm；注射后2周平均吸收26.51%；注射后1個月平均吸收32.18%；注射后3個月平均吸收42.19%；A、B組的直徑減少率隨著時間的增加而增大，但無統計學差異。

2.4組織學觀察：2周時發現混懸液包塊仍然與皮膚之間的連接不夠緊密，有晃動現象；常規包埋后，進行常規HE染色觀察發現，陶瓷顆粒為不透光物質，所以光鏡下為黑色團塊，顆粒與周圍組織之間界限清楚，沒有明顯連接，無明顯的纖維包膜形成，無明顯炎性細胞浸潤（圖3）。4周時發現混懸液包塊與皮膚之間的連接較為緊密； HE染色觀察發現，陶瓷顆粒與皮膚組織連接明顯，但組織形態不明顯，細胞分布也較為疏密，周圍無明顯炎性細胞浸潤無纖維包膜形成（圖4）；12周時觀察，發現混懸液包塊與皮膚之間的連接緊密； HE染色觀察發現，光鏡仍能觀察到的陶瓷顆粒，顆粒周圍皮膚組織形態典型，可見顆粒與皮膚組織連接緊密，同時細胞分布致密（圖5）。

免疫組化顯示：沒有BMP2（骨形成蛋白2）陽性結果出現，即各組別中沒有BMP2的表達（圖6）。

圖1　混懸液注射到兔背部皮下

圖2 混懸液形成均勻，流動性好

圖3　2周時顆粒與周圍組織之間界限清楚，沒有明顯連接（400×）

圖4　4周時陶瓷顆粒與皮膚組織連接明顯，但組織形態不明顯，細胞分布也較為疏密（400×）

圖5　12周時光鏡仍能觀察到的陶瓷顆粒，顆粒周圍皮膚組織形態典型，可見顆粒與皮膚組織連接緊密，同時細胞分布致密（400×）

圖6　免疫組化顯示：沒有BMP2（骨形成蛋白2）陽性結果出現，即各組別中沒有BMP2，的表達（400×）

3　討論

生物材料的替代治療是現代整形外科重要的治療手段之一［8］。近年來，注射美容技術和相關產品的發展為微創治療提供了可能，通過注射方式將填充劑直接注入需要的層次，并捏塑成型，達到糾正面部缺損、凹陷，直至形成完美的外觀。注射填充的發展主要取決于填充劑的研究與開發，面部的骨性缺損、發育不良及軟組織凹陷所致的畸形及外觀欠佳已經成為目前整形美容外科最常見的診療項目。傳統的手術方法有著良好的效果，但帶來創傷及并發癥較多。有些由于骨性結構的缺損，凹陷甚至發育不足（如小頦畸形）導致的畸形及不完美，通過透明質酸等軟組織填充劑來改善，硬度及塑形性滿足不了臨床需要，最后呈現的效果也不盡理想［9-10］。

β-磷酸三鈣生物陶瓷是一種骨填充材料，主要應用在骨科、口腔、整形、眼科、耳鼻喉科及組織工程等領域的臨床骨缺損的填充及非荷重部位的骨缺損治療。β-磷酸三鈣具有良好的生物相容性。研究表明，新西蘭白兔種植試驗可見周圍組織長入材料中，β-磷酸三鈣生物陶瓷在體內能被完全為鈣和磷，一般1～2年基本降解吸收［11-12］。

本實驗以β-磷酸三鈣生物陶瓷顆粒與透明質酸形成混懸液制備成新的注射填充材料。在動物體內進行植入，觀察組織學反應，提取的組織切片均顯示注射材料不會引起組織產生炎癥反應，隨時間推移組織細胞與材料結合緊密，說明制備的新填充材料具有較好的組織相容性。本實驗采用的是無交聯的玻尿酸，故注射后透明質酸2周左右即吸收結束，β-磷酸三鈣生物陶瓷則可以長期持續，3個月還保持原有形態，說明其填充效果良好，代謝時間長，形態維持良好，臨床上塑形性強［13］。同時，免疫組化提示BMP2無顯示，骨形態發生蛋白2是一種分泌性多功能蛋白，具有誘導未分化的間充質干細胞向成軟骨細胞和成骨細胞定向分化與增殖的能力，促進成骨細胞分化成熟，參與骨和軟骨的生長發育及其重建過程，進而加速骨缺損的修復［14-15］；BMP2的出現提示局部有成骨的表現，本實驗結果顯示無BMP2的表達提示注射材料周圍無成骨現象，說明β-磷酸三鈣生物陶瓷在軟組織中不會誘導成骨，可以安全作為組織填充劑進行應用。本實驗采用了β-磷酸三鈣生物陶瓷與透明質酸3∶17及3∶12的比例進行配置，大于3∶12比例配置后粘滯度太大，不利于注射推注，但怎樣配置更好，配置比例如何才能達到最好效果，還有待于進一步研究，同時將注射β-磷酸三鈣生物陶瓷注入到骨膜下能否誘導成骨，是否能為骨缺損提供骨修復的可能也需要進一步研究。

本實驗證實將透明質酸與β-磷酸三鈣生物陶瓷顆粒進行混合形成混懸液進行注射治療可行性較高，注射后與周圍組織相容性好，無排斥及變態反應發生，β-磷酸三鈣生物陶瓷顆粒與透明質酸混懸液作為一種新型注射類填充劑的嘗試還需要進一步的研究。

［1］Xiao X，Wang W，Liu D，et al.The promotion of angiogenesis induced by three-dimensional porous beta-tricalcium phosphate scaffold with different interconnection sizes via activation of PI3K/Akt pathways［J］.Sci Rep，2015，23，5：9409.

［2］盧建熙，湯亭亭，丁惠峰，等.生物陶瓷微顆粒引發的細胞和組織損害［J］.生物醫學工程學雜志，2006，23（1）：85-89.

［3］崔旭，馬遠征，李大偉，等.β-磷酸三鈣/聚乳酸-聚羥基乙酸/異煙肼/左氧氟沙星緩釋材料的成骨檢測［J］.中國組織工程研究，2013，17（3）：381-386.

［4］Gutowski KA.Hyaluronic Acid Fillers：Science and Clinical Uses［J］. Clin Plast Surg，2016，43（3）：489-496.

［5］王姜玲，冉維志.透明質酸及其衍生物的現狀和發展趨勢［J］.黑龍江醫藥科學，2014，37（6）：117-118.

［6］Bass LS.Injectable Filler Techniques for Facial Rejuvenation，Volumization，and Augmentation［J］.Facial Plast Surg Clin North Am，2015，23（4）：479-488.

［7］劉慶陽，史毅，王惠東，等.兔骨髓間充質干細胞的分離、培養與鑒定［J］.組織工程與重建外科雜志，2008，4 （2）：69-72.

［8］黃明歡，宋建星.透明質酸填充注射在醫學美容中的臨床應用和并發癥［J］中國美容醫學，2012，21（5）：168-171.

［9］高琳，王延婷，堅哲，等.多層次不同劑型透明質酸鈉溶液注射在面部年輕化治療中的療效分析［J］.臨床皮膚科雜志，2016，45（4）：302-305.

［10］董彭濤.透明質酸注射與硅膠假體在美容整形隆鼻術中的臨床應用比較［J］.吉林醫學，2015，36（14）：3059.

［11］Dai LY，Jiang LS.Single-Level Instrumented Posterolateral Fusion of Lumbar Spine With β-Tricalcium Phosphate Versus Autograft ［J］. Spine （Phila Pa 1976），2008，20，33（12）：1299-1304.

［12］Zhang F1，Chang J，Lu J，et al.Bioinspired structure of bioceramics for bone regeneration in load-bearing sites［J］.Acta Biomater，2007，3（6）：896-904；Epub 2007 Jun 26.

［13］馬超，王臻，盧建熙，等.球形β-TCP生物陶瓷的生物學性能觀察［J］.科學技術與工程，2008，8（5）：1146-1150.

［14］楊再清，孟增東.骨形態發生蛋白9誘導成骨分化及其在骨科中的應用［J］.中國組織工程研究，2012，16（37）：6987-6992.

［15］黃暉，楊志.骨形態發生蛋白在骨組織工程中的臨床應用［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（2）：340-343.

Experimental study onβ-Tricalcium Phosphate /Hyaluronic acid composite on injectable tissue filler

LIU Qing-yang1，LU Jian-xi2，ZHOU Zhi-hua3，GUO Xin-wen1，PAN Shu-ya1，LI Ping1，YAO Chen-wei2
（1.Department of Plastic Surgery，Shanghai RENAI Hospital，Shanghai 200235，China； 2.Shanghai Bio-Lu Biomaterials CO.，Ltd，Shanghai 201114，China； 3.Shanghai First People's Hospital，Shanghai 200080，China）

Objective The purpose of this study was to observe the effection of β-Tricalcium Phosphate /Hyaluronic acid composite as a new kind of tissue fller. Methods β-Tricalcium Phosphate /Hyaluronic acid composite were used to make two kinds of composite （A，B） for different proportion （3∶17， 3∶12）. Physiological saline was control group. Twelve new Zealand rabbits were divided into 3 groups. The composites were injected randomly on the back of rabbit. Some of the rabbits were killed to be evaluated with histology at the time points 2，4 and 12 weeks after injection. Results No rejection and infammation were found on the back of the rabbits of A and B. Fiber tissue surrounding the composite was not pronounced. No osteogenesis phenomenon（bone morphogenetic protein2） were found at 1-12 weeks postoperatively. Conclusion β-Tricalcium Phosphate / Hyaluronic acid composite has good tissue compatibility and plasticity.It was not toxic and slow absorption.It did not produce Osteogenesis phenomenon in the soft tissue.This composite may become a new kind of injectable fller.

β-Tricalcium Phosphate； Hyaluronic acid； injection； tissue fller；bone morphogenetic protein2

R318

A

1008-6455（2016）08-0044-03

2016-05-15

2016-07-26

編輯/張惠娟

上海市衛生和計劃生育委員會科研課題資助項目（20134284）