一種藍藻生物量長期原位實時監測儀的研制*

楊　飛，陶志浩，鄭貴林

（武漢大學自動化系，武漢430072）

一種藍藻生物量長期原位實時監測儀的研制*

楊飛*，陶志浩，鄭貴林

（武漢大學自動化系，武漢430072）

近年來，各類水體藍藻水華災害頻繁發生，導致水體生態系統功能退化和破壞，并嚴重危害到水產養殖和用水安全。對水體中藍藻生物量進行長期實時監測是防治藍藻水華災害的一項必要措施。基于藍藻中所含藻藍蛋白的特征熒光效應，即采用620 nm波長的強光激發出645 nm波長的熒光并通過檢測其強度來推算水中藍藻生物量，最終研制出了一種能對水體中活體藍藻生物量實現原位快速監測的儀器，輔以專門設計的自清洗功能使之能長期免于人工維護和校準。為滿足對廣闊水域的時空分布動態監測的需要，采用GPS技術獲得各測點地理位置信息，還采用無線通信技術實現其與監測中心的遠程實時在線數據通信，藉此擴展了其實用范圍。實驗結果表明，藍藻生物量與檢測值的線性相關系數可達0.98以上，可見檢測值能精確地反映藍藻濃度的變化。

藍藻生物量；原位監測；熒光效應；自清洗

EEACC：7230Jdoi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.05.025

藍藻（Cyanobacteria）又稱藍細菌、藍綠菌或藍綠藻，是一種能進行產氧性光合作用的原核生物，其在地球上已存在了30多億年，對地球表面從無氧的大氣環境變為有氧環境起到了巨大的作用。近些年來，由于人類活動的影響，水體富營養化的現象屢見不鮮，這些水體中經常出現異常大量繁殖的藍藻，極易堆積、腐爛沉降從而造成大面積水華現象，其危害十分巨大［1-2］。例如：藍藻的大量繁殖惡化了水體中的通風、光照和含氧環境，破壞了水體生態系統，壓縮了魚類和其他生物的生存空間，且其產生的異味物質和毒素會嚴重影響到飲用水源和水產品的安全，乃至危害到人類身體健康。對水體中藍藻生物量進行監測是預警和防治藍藻水華災害工作的重要環節［2-3］。同時，隨著飲用水安全問題的日益突出，國內各主要湖區水庫都已開始對水體的富營養化進行監測，藍藻水華是水體污染的顯著標志，也是水體富營養化的直觀表征［4］。因此，對水體藍藻生物量進行監測對水體富營養化程度評價也具有參考意義。

對于水體中藍藻生物量的測定，傳統的方法一般都是通過將采集的水樣濃縮成標本后帶回實驗室，由專業分析人員在顯微鏡下觀察統計藍藻個體總數［5］。這種群落人工計數法對分析人員的專業素養要求很高，在實際工作中往往精度難以得到保證，而且需要耗費大量時間和人力；更重要的是，由于不能在原位進行快速檢測，所以并不適應快速、連續的藍藻預警和監測的需要。近些年來，為了滿足對日益頻發的藍藻水華現象進行監控的需要，多光譜遙感技術開始在各國得到應用［4，6］。水體的光譜特征是由其中的各種物質對光輻射的吸收和散射性質決定的，即水體中藍藻生物量濃度的差異，使水體顏色、密度、透明度等產生差異，從而使圖像傳感器上接收到的光譜特征存在差異，在遙感圖像上反映為色調、灰階、形態、紋理等特征的差別。基于此原理，可以通過研究水體反射光譜特征與水體浮游生物量之間的關系建立反演算法。盡管使用遙感技術監測藍藻具有可快速同時監測大面積水域的優點，但因遙感圖像數據來自于搭載在各種遙感平臺上的傳感器，其成像效果容易受到云層等因素的影響［7］，所以只能用于大致判別藍藻水華是否已經大面積暴發，并不能精確地監測藍藻水華暴發前水體中藍藻生物量的變化過程。因此需要研究滿足對水體各處藍藻生物量進行長期原位監測的儀器，而熒光法可能是目前最具現實應用價值的檢測方法。自Lorenzen［8］率先利用葉綠素的熒光效應成功地連續檢測海水中活體葉綠素a的濃度后，利用此原理檢測水中浮游植物生物量已是被廣為接受的檢測方法［9-11］。由于葉綠素a在各種浮游植物中廣泛存在，藍藻中也含有葉綠素a，故難以通過葉綠素的熒光效應從浮游植物群落中準確區分出其中藍藻的生物量。本文根據藍藻中特有的藻藍蛋白的熒光效應，研制出一種能對水體中藍藻生物量進行原位快速檢測的儀器。研究中還發現，由于這類利用熒光效應原理的原位檢測儀在各類水體中的工作時，儀器中長期與水體直接接觸的光學部件都將不可避免地受到水體中各種雜質或浮游植物等的粘附，將會阻礙激勵光和發射光的傳播路徑，導致藍藻活體受照射的和檢測到其發射的光強均會減弱，從而會導致藍藻生物量檢測結果比真實值偏低，這一現實應用中存在的問題在公開文獻中鮮有提及。為了盡量延長藍藻濃度監測儀的人工維護周期并降低使用成本，本文所研制的儀器專門設計有自清洗裝置，可對光學核心部件進行自動清洗，防止有害的粘附。另外，為滿足對廣闊水域的時空分布動態監測的需要，通過采用GPS技術獲得各測點位置信息，還采用無線通信技術實現其與監測中心的遠程實時數據通信，藉此擴展了其實際應用范圍。

1　熒光法檢測原理

當用高強度的光射入某種物質時，該物質中的電子吸收能量從基態躍遷到高能級，此時由于電子處于高能級非穩態，就會從高能級躍遷至低能級，從而釋放能量發出波長更長的光，這種現象稱為熒光效應。一般情況下，單位體積內這種具有熒光效應的物質越多，在同樣強度的激勵光照射下，釋放出的熒光強度也就越大。由于激勵光和發射熒光的波長不同，因此只要選擇一組合適的窄帶帶通濾光片，即可將激勵光和發射熒光區分開來，從而可達到通過檢測發射熒光強度來度量該物質濃度的目的，這就是熒光法檢測的基本原理。研究發現［12］，當用可見光照射藍藻時，其所特有的藻藍蛋白在受強光激勵后會立即以輻射躍遷形式將其吸收的能量釋放出，同時會發射出中心波長為645 nm的熒光，其吸收光譜主要是620 nm左右的可見光。

根據藻藍蛋白的這種特征熒光效應，本文采用一種中心波長為620 nm的單色光照射待測水樣，以激發出中心波長為645 nm的熒光，然后通過檢測所激發熒光的強度進而推算出水樣中藍藻生物量濃度值。發射的激勵光譜避開了葉綠素a在可見光波段的2個最強吸收區：波長為640 nm～660 nm的紅光波段和波長為430 nm～470 nm的藍紫光波段，因此能大大降低水樣中所含葉綠素a對檢測結果的干擾。使用這種方法檢測藍藻生物量，其待檢測水樣不需要預處理和等待，特別適合在原位快速檢測水體中各處的藍藻生物量。

研究表明，物質激發出的熒光強度F與其摩爾吸光系數ε、濃度c、熒光效率φ、樣品的光程b、熒光檢測儀器常數k及激勵光強度I0有密切關系。當待測物質及檢測儀器確定后，ε、φ、b、k均為常數。根據Beer-Lambert定律，物質的熒光相對強度可用下式表示［9］：

展開式（1）中的指數項后可得：

當εcb的值很小時，式（2）中括號內的展開項第二項及其后項可忽略不計，它可簡化為：

由式（3）可見，在某一固定頻率和強度為I0的入射光激勵下，發射的熒光強度與該物質的溶液濃度成正比。因此通過檢測接收到的激發熒光的強度即可推算出藍藻生物量濃度值。

2　系統設計與實現

2.1系統結構設計

本文設計的藍藻生物量監測儀系統如圖1所示，它以單片機MCU作為控制核心，主要由激勵光源子系統、熒光檢測子系統、清洗子系統和通信子系統組成。

圖1　系統設計框圖

下文將對各關鍵子系統給出詳細設計說明。監測系統的主要工作流程如圖2所示：首先單片機控制水泵將水樣抽取至檢測腔，接著激勵光源子系統調制發射波長為620 nm的發光二極管（LED）光源對檢測腔中的水樣進行照射，同時熒光檢測子系統中的光電轉換器件（高靈敏光敏管）接收藍藻體內的藻藍蛋白受激發出的熒光并轉變為電流信號，再經過I/V轉換、放大、濾波、檢波等信號調理后進行A/D轉換，然后由單片機讀取A/D轉換后的數據即為檢測結果。最后，單片機還需控制水泵對檢測腔內部進行沖洗并排干水。水樣被抽至檢測腔內后，從控制LED發射激勵光到讀取到發射熒光轉換成的電壓值的所用時間極短，能滿足實時檢測的需要。該系統在野外工作，因此采用了太陽能板和蓄電池供電。

考慮到現實應用中往往需要對大面積水域進行多點同時監測，且監測點往往會設在離岸邊較遠的水中。因此監測儀還專門設計有數據遠傳通信接口，既可通過RS485有線通信方式或Zigbee無線模塊將監測數據傳輸至幾公里以內的本地監測中心，還可連接GPRS/3G/4G公網無線通信模塊將檢測數據遠程傳送到任意地點的接有互聯網的監測中心，并可接收監測中心的控制指令。根據需要，監測儀還可外接GPS模塊，通過讀取其授時時間和經緯度數據得到所在地的準確時間和地理位置，監測中心可利用這些數據和GIS地理信息系統實現對廣闊水域的時空分布動態監測。

圖3為本文所設計的監測中心上位機軟件的工作界面。圖3中橫軸表示時刻，其單位是小時，縱軸表示藍藻濃度值，其單位是cells/mL，該實時曲線為當天0∶00～15∶00每隔1h自動檢測1次的藍藻實時濃度值。

圖2　系統主要工作流程示意圖

圖3　監測中心上位機軟件工作界面

2.2儀器機械結構設計

在儀器的機械結構設計中，由于檢測腔是整個檢測儀器的核心裝置，所以必須進行重點考慮。如圖4所示，本文所設計的檢測腔裝置主要包括：①激勵光源腔，用于安裝LED光源，向下發射光照射檢測腔中的水樣；②激勵光路帶通濾光片，將LED發出的光進行過濾，僅使620 nm左右窄帶內波長的光通過射入下方的待測水樣；③清洗噴嘴，用于泵入高速水流沖洗對面的檢測窗口；④檢測腔體，該腔體為遮光密閉結構，內壁加工光潔度要求高，以盡量減少雜物粘附且便于清洗；⑤接收光路帶通濾光片，僅使650 nm左右窄帶內波長的光進入到右邊熒光接收模塊；⑥檢測窗前端半球凸透鏡，用于匯聚水樣中藍藻受激產生的微弱熒光；⑦熒光接收模塊，用于將接收到熒光信號轉換成電信號；⑧排水口，與雙向泵連接，用來將水樣泵入到檢測腔進行檢測，檢測完后再由此排出，避免水樣在檢測腔體中長期浸泡后粘附到檢測窗表面。

圖4　檢測腔裝置結構示意圖

該檢測腔裝置的實物圖見圖5左圖上部分黑色主體部分。圖5左圖下部分的金屬盒為儀器的電氣控制部分，其內部結構和接線如圖5右圖所示。

圖5　儀器樣機及其內部電路照片

2.3激勵光源子系統

對于激勵光源子系統而言，由于水體中的藍藻（藻藍蛋白）含量通常較低，因此需要保證激勵光源的亮度足夠大。針對藻藍蛋白的光學吸收特性，本文所設計的儀器選用中心波長為620 nm的多個高亮LED作為激勵光源。相比以往研究中廣泛使用的氙燈或氦氖激光器，采用LED作為激勵光源具有體積小、功耗低、散熱小、響應快、壽命長、單色性好和工作電壓低等優點，適用于在野外工作的小型儀器。其下安裝了中心波長為620 nm的窄帶濾光片，其半波帶寬為10 nm，以盡量保證只有所需的特征波段的激勵光線射入水樣。LED的發光強度由驅動電流決定，驅動電流的大小和波動都會直接影響LED激勵光源的激勵效果，進而對儀器的穩定性和可靠性有很大的影響。在本系統中，激勵光源驅動電路采用GS6300為LED提供恒定的驅動電流，以獲得穩定的激勵效果。GS6300是一款高效率、恒流、恒壓芯片，輸入電壓范圍為4.5 V～40 V，方便在野外使用時用電池供電，輸出電壓1.3 V～37 V可調節，輸出電流可高達3A。LED恒流驅動電路如圖6所示，其輸出電流值為1.55 A，在-40～125℃范圍內能穩定工作。MOSFET管與LED串聯接至驅動電路的輸出端，并由MCU控制MOSFET管的導通和截止來控制LED激勵光源的啟停。

圖6　LED恒流驅動電路

2.4熒光檢測子系統

由于水體中的藍藻即使是在強光激勵下發射的熒光，其光強依然很弱，因此熒光接收檢測系統需要具有很高的靈敏度，從而保證整個系統設計的有效性。將接收到的熒光轉換成電信號的光接收器件的靈敏度在很大程度上決定了檢測性能。常用的光接收器件有光電池、光敏電阻、光敏管、光電倍增管等。本文選用日本濱松公司的S1336光敏管作為接收熒光的傳感器，其在波長為645 nm左右波段的光靈敏度可達0.35 A/W。需要指出的是，在以往熒光檢測研究中廣泛使用的光電倍增管雖然靈敏度很高，但其工作電壓非常高，體積也較大，比較適合應用于實驗室檢測儀器中，難以滿足野外現場使用中對功耗和體積的要求，因此本文挑選了工作電壓低、體積小便于集成的光敏管來實現光電轉換。

為了更好地接收特征波長的熒光，在光敏管感光窗口前安裝了半球凸透鏡用于匯聚熒光光線，還安裝了中心波長為650 nm帶通濾光片（半波帶寬為10 nm），以阻止激勵光線在水樣中被折射和反射后形成的雜散光射向光接收器件。由于激勵光和發射熒光的波段相隔較近，因此盡管發射熒光的峰值波長為645 nm，但本文在選擇接收濾光片時沒有選擇中心波長為645 nm的帶通濾光片，而是選擇了中心波長為650 nm帶通濾光片，以盡量消弱激勵光源射向光敏管的光線。

2.5清洗子系統

原位監測相比取樣送檢具有很多的優點，它能真實并且快速地測得所選測點處水體的藍藻生物量變化情況，但也比檢測技術提出了更高的要求。水體藍藻原位監測常要求監測儀就近安裝或直接浸于水中，對儀器的校準或維護常受到野外水域環境的制約不便經常開展，而藍藻的防治又恰恰需要對水體進行長年的不間斷監測。藍藻監測儀在長時間的使用過程中，儀器中長期與水體直接接觸的光學部件都將不可避免地受到水體中各種雜質或浮游植物等的粘附，這將阻礙激勵光和發射光的傳播路徑，導致藍藻活體受照射的和檢測到其發射的光強均會減弱，從而藍藻濃度檢測結果比真實值偏低，嚴重影響了監測結果的準確性。針對類似問題，傳統的水質傳感器均采用人工維護的辦法，即定期將傳感器取出，人工清洗傳感器表面和內部污垢及附著微生物，有時還需進行再次標定和校準。在維護期間，監測過程被強行中斷，不但存在維護技術難度和成本的問題，而且維護過程往往繁瑣耗時，如此會使相關人員疲于維護或懶于維護，因此可能還會因此導致監測結果不可信的后果。

針對這一問題，本文專門設計了自維護技術，利用雙向水泵先將水樣抽入檢測腔，待測完后再完全排出，避免水樣長期浸泡光學檢測窗。在光學檢測窗對面專門設計有一個清洗噴嘴，每次檢測完成后使用一定的壓力將清洗液噴至光學檢測窗，以沖洗可能粘附在其上的各種雜質，再由雙向泵排出清洗液，反復多次還可達到清洗檢測腔內部的目的。沖洗液可以是取自附近水體并經過濾后的凈水，也可配備其他對水體無害無污染的洗滌液。這種方法實用有效，針對性強，且不會大幅增加儀器的成本。

3　實驗結果

為驗證監測儀對真實水體中藍藻生物量的檢測效果，分別于2015年9月6日和10月26日從武漢市沙湖湖內取得1號水樣和2號水樣，各自測定水樣中藍藻的特征熒光強度，即通過讀取熒光強度檢測輸出的電壓值，獲得水樣中藍藻生物量的相對測算值。實驗時，將取得的原始水樣以蒸餾水等比例稀釋成不同倍數，再利用本監測儀分別檢定稀釋后的水樣，檢測值結果見表1和表2所列，每個數據皆為重復檢測5次后所求的平均值，在現場監測中也是依此方法求均值來得到最終檢測值。另外，還將這2次檢測實驗中的熒光強度值與水樣相對濃度值進行線性擬合，如圖7所示。

表1　1號水樣測量實驗數據

表2　2號水樣測量實驗數據

圖7　水樣實驗測量結果

由圖7可見，水樣的相對濃度與電壓值呈良好的線性關系，檢測值能較好地反映稀釋濃度變化。1號水樣所對應的線性回歸方程為y=2 835.2x+676，相關系數為0.994 5；2號水樣所對應的線性回歸方程為y=649.8x+642，相關系數為0.988 4。1號水樣與2號水樣取樣時間相隔50 d，雖然它們的檢測結果都具有良好的線性關系，但是它們的檢測值相差很大。分析其原因可得：10月份與9月份相比，水體平均溫度相對較低且光照較弱，從而導致藍藻的生長緩慢，濃度明顯下降，這一現象符合湖泊中藍藻的生長規律。其線性相關系數變化不大，說明儀器的檢測一致性較好。故此可見通過真實水體水樣驗證了本監測儀對藍藻生物量具有較高的檢測準確度。通過群落人工計數法對水樣中的藍藻進行標定后，得到監測儀的最低檢出限值約為0.6×103cells/mL，通過標準藍藻溶液標定得到該監測儀在低放大倍數檔時的線性區域上界為1.9×105cells/mL。用不含藍藻的浮游植物混合液進行同樣的實驗，多次成倍稀釋后的檢測值無明顯變化，幾乎總是保持在590 mV左右這一水平。這是因為藻藍蛋白是藍藻中所特有的一類熒光物質，其他浮游植物群落基本上不含藻藍蛋白，因此不能激發出相同特征波長的熒光而被儀器檢測到，所以其檢測值亦不能反映混合液的濃度變化。

4　結論

本文利用藍藻中藻藍蛋白的特征熒光效應，自主研制出了一種可用于河流、湖泊、水庫、海洋等水體環境的藍藻生物量監測儀，它具有實時在線、長期免維護以及支持廣闊水域時空分布監測的功能。該儀器主要由激勵光源子系統、熒光檢測子系統、清洗子系統和通信子系統組成，具有小型化、低功耗、檢測速度快等特點。相對國外藍藻生物量檢測儀器，具備成本低，結構簡單，維護周期長，通信接口豐富便于擴展等優勢。藍藻生物量檢測實驗結果表明，其檢測值與藍藻濃度值具有良好的線性關系，檢測靈敏度和準確度較高。該儀器可廣泛應用于湖泊藍藻水華的監測和預警，以及海洋環境污染調查、漁情預報、海產養殖的水質監測與控制等，應用前景十分廣闊。

［1］Otten T G.，Paerl H W.Health Effects of Toxic Cyanobacteria in US Drinking and Recreational Waters：Our Current Understand?ing and Proposed Direction［J］.Current Environmental Health Re?ports，2015，2（1）：75-84.

［2］李媛，張家衛，魏杰，等.我國藍藻水華的發生機理、危害及防控利用研究進展［J］.微生物學雜志，2015，35（4）：93-97.

［3］黃君，張虎軍，江嵐，等.太湖藍藻水華預警監測綜合系統的構建［J］.中國環境監測，2015，31（1）：139-145.

［4］黃君，莊嚴，宋挺，等.3S技術在太湖富營養化和藍藻水華分布規律中的應用研究［J］.環境污染與防治，2014，36（12）：31-37.

［5］國家環保總局.水和廢水監測分析方法（第四版，增補版）［M］.北京：中國環境科學出版社，2002：701-707.

［6］Lunetta R S，Schaeffer B A，Stumpf R P，et al.Evaluation of Cyano?bacteria Cell Count Detection Derived From MERIS Imagery Across the Eastern USA［J］.Remote Sensing of Environment，2015，157：24-34.

［7］Wang G，Li J，Zhang B，et al.Monitoring Cyanobacteria-Dominant Algal Blooms in Eutrophicated Taihu Lake in China with Synthet?ic Aperture Radar Images［J］.Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2015，33（1）：139-148.

［8］Lorenzen C.A Method for Continuous Measurement of In Vivo Chlorophyll Concentration［J］.Deep-Sea Research，1966，13：223-227.

［9］金海龍，王玉田.基于熒光發射光譜的活體海藻識別方法研究［J］.傳感技術學報，2006，19（1）：97-111.

［10］金海龍，王玉田.基于熒光法和多元回歸分析的混合海藻識別方法研究［J］.傳感技術學報，2006，19（4）：1198-1201.

［11］崔建升，呂鵬翼，段莉麗.海水葉綠素現場檢測儀的研制及性能研究［J］.分析儀器，2014（1）：12-16.

［12］Lee T，Tsuzuki M，Takeuchi T.et al.In Vivo Fluorometric Method for Early Detection of Cyanobacterial Waterblooms［J］.Journal of Applied Phycology，1994（6）：489-495.

楊飛（1981-）男，博士，講師，本文通訊作者，現主要從事智能傳感器與檢測技術方面的研究工作，young-free@tom.com；

陶志浩（1989-）男，碩士研究生，主要為研究方向測控技術與儀器；

鄭貴林（1963-）男，博士，教授，博士生導師，現主要為從事智能傳感器與檢測技術方面的研究工作。

Design of a Long-Term and Real-Time In-Situ Monitor for Cyanobacterial Biomass*

YANG Fei*，TAO Zhihao，ZHENG Guilin
（Department of Automation，Wuhan University，Wuhan 430072，China）

In recent years，cyanobacterial blooms occurred frequently in kinds of water bodies，which resulted in deg?radation and impairment of water ecological function，as well as serious harm to aquaculture and other water utiliza?tion.The long-term and real-time monitoring of cyanobacterial biomass in water bodies is an essential measure to prevent and harness cyanobacterial blooms.Based on phycocyanin fluorescence from vivo cyanobacteria，the strength of the fluorescence at 645 nm excited by the 620 nm bright light is detected to evaluate the cyanobacterial biomass in water，and finally a rapid and in-situ monitoring instrument for cyanobacterial biomass in water bodies is developed，supplemented by a specially designed self-cleaning device to keep from manual maintenance and calibra?tions for long-term monitoring.To meet the demand of dynamic monitoring of the temporal and spatial variation of cy?anobacterial biomass in vast water areas and expand the practical range，the GPS technology is utilized to obtain the geographical position information of each monitoring site，and the wireless communication technology is employed to realize the remote real-time online data communication among monitoring sites and the monitoring centre.The exper?imental results show that the linear correlation coefficients of the cyanobacterial biomass and the detection values ex?ceed 0.98，and thus the detection values could reflect the variations of the cyanobacterial concentration accurately.

cyanobacterial biomass；in-situ monitoring；fluorescence effect；self-cleaning

X85

A

1004-1699（2016）05-0769-07

項目來源：水利部科技推廣項目（TG1150）；國家海洋局“海洋可再生能源專項資金項目”（GHME2013JS01）；廣東省海洋經濟創新發展區域示范專項項目（GD2012-C03-006）

2015-12-01修改日期：2016-01-21