成人慢性ITP患者外周血CD4+CD25+CD127-/low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、TCRv24+v11+NKT細(xì)胞和Th1/Th2細(xì)胞因子的變化

邵鳳，徐瑞龍，鄭昭璟，馬擁軍，胡少龍

成人慢性ITP患者外周血CD4+CD25+CD127-/low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、TCRv24+v11+NKT細(xì)胞和Th1/Th2細(xì)胞因子的變化

邵鳳，徐瑞龍，鄭昭璟，馬擁軍，胡少龍

目的探討成人慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）患者外周血自然殺傷T細(xì)胞（NKT）和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的變化及關(guān)系。方法利用多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ITP患者和健康體檢者外周血NKT和Tregs細(xì)胞，雙色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血網(wǎng)織血小板（RP）數(shù)量，CBA技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析血清IL-12p70、IL-10、IL-2、IL-8、IL-6、IL-5、IL-4、IL-1b、IFN-、TNF-和TNF-水平。結(jié)果慢性ITP組RP高于健康對(duì)照組（＜0.05）；但兩組NKT細(xì)胞比例、11種血清細(xì)胞因子水平、Th1/Th2型細(xì)胞因子比值及1型/2型細(xì)胞因子比值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。Plt計(jì)數(shù)＜20×109/L的慢性ITP患者組RP及NKT高于健康對(duì)照組和Plt計(jì)數(shù)＞20×109/ L的慢性ITP患者組（均＜0.05）。慢性ITP患者外周血Plt計(jì)數(shù)與NKT細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（=-0.373，=0.033）。ITP組患者外周血Tregs和NKT細(xì)胞無關(guān)，但是Tregs細(xì)胞與Th1/Th2細(xì)胞因子比值呈正相關(guān)（=0.451，=0.011），血小板數(shù)與血清IL-12p70、IFN、IL-4及TNF也呈正相關(guān)（=0.354、0.365、0.354、0.366，均＜0.05）。結(jié)論NKT細(xì)胞和Tregs細(xì)胞可能與慢性ITP患者中細(xì)胞因子分泌的異常有關(guān)。

紫癜，血小板減少性，特發(fā)性，慢性；自然殺傷T細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；細(xì)胞因子譜；網(wǎng)織血小板

特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）是一種以1型T細(xì)胞反應(yīng)為主的自身免疫性疾病，以外周血血小板計(jì)數(shù)（Plt）持續(xù)＜100×109/L為特征［1-4］。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）和自然殺傷T細(xì)胞（NKT）是兩種具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群。研究證明，活化的NKT細(xì)胞能通過IL-2依賴機(jī)制調(diào)節(jié)Tregs細(xì)胞的功能，而Tregs細(xì)胞能通過細(xì)胞接觸依賴機(jī)制抑制NKT細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒活性［5］。本研究對(duì)慢性ITP患者外周血NKT、Tregs、血清細(xì)胞因子譜進(jìn)行分析，探討上述因素在ITP中的變化。報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2008年1月至2010年3月浙江省金華中心醫(yī)院就診的活動(dòng)期慢性ITP患者68例，符合慢性ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。其中男40例，女28例；年齡（43.82±2.46）歲；PLT（26.69± 3.90）×109/L。另選年齡、性別匹配的同期健康體檢者38例為健康對(duì)照組，其中男24例，女14例；年齡（38.53±1.97）歲；PLT（230.84±11.29）×109/L。受試者在標(biāo)本采集前2周內(nèi)均未進(jìn)行激素治療或其他可以影響血小板代謝的藥物。按照Plt將慢性ITP患者分為兩組，即＜20×109/L和＞20×109/L。

1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMNC）的分離受試者靜脈穿刺6 ml，用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，以等量0.9％氯化鈉注射液稀釋后置于6 mlLympho-Prep密度梯度分離液上置水平離心機(jī)800 r/min室溫離心20 min；以毛細(xì)滴管吸取介于分離液和血漿層間的單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另外一根試管內(nèi)，加入等量0.9％氯化鈉注射液，300 r/min室溫繼續(xù)離心10 min；去上清，漩渦振蕩重懸單個(gè)核細(xì)胞，以pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，重復(fù)3次；最后PBS重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/ml待用。

1.3網(wǎng)織血小板（RP）的檢測(cè)利用EDTA-K2抗凝全血，在樣品采集后2 h內(nèi)完成。在對(duì)照管和測(cè)定管中加入5 l PE熒光標(biāo)記血小板膜糖蛋白（CD41-PE）抗體，PBS 30l，加混勻全血標(biāo)本5l，漩渦振蕩混勻后避光室溫孵育15 min；孵育后在測(cè)定管中加入IOSTONⅢ10倍稀釋的噻唑橙試劑（TO）1 ml，在對(duì)照管中加入IOSTONⅢ液1 ml，避光室溫孵育1h后上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)以SSC對(duì)數(shù)放大信號(hào)（SSC Log）和CD41設(shè)門識(shí)別血小板。CD41+TO+的顆粒為RP。利用對(duì)照管進(jìn)行TO陽(yáng)性域值的設(shè)定。每次實(shí)驗(yàn)至少計(jì)數(shù)5 000個(gè)血小板，同時(shí)每次測(cè)定均平行檢測(cè)Plt正常人的RP。RP的結(jié)果以占全部血小板的百分比表示。

1.4CD4+CD25+CD127-/lowTregs的檢測(cè)采用三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tregs細(xì)胞。取2根12 mm×75 mm流式試管分別標(biāo)記同型對(duì)照和測(cè)試管，按照試劑說明書進(jìn)行抗體標(biāo)記染色；吸取20l Cocktail of FITC anti-human CD4和PE anti-humanCD25至試管底部，在同型對(duì)照管中加入IgG1-PE-Cy5 10l，在測(cè)試管中加入CD127-PE-Cy5 20 l；每管中均加入100 l5×106/ml的PBMNC，漩渦振蕩混勻后避光、室溫孵育15 min；每管中加入PBS 2 ml混勻，置水平離心機(jī)350 r/min室溫離心5min；棄上清，加0.5ml PBS重懸細(xì)胞、待測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)分析中，以SSC/FSC結(jié)合SSC/CD4設(shè)門圈定CD4+淋巴細(xì)胞分析其中CD4+CD25+CD127-/low細(xì)胞占CD4+的百分比即為Tregs細(xì)胞水平。每次測(cè)試至少檢測(cè)70 000個(gè)CD3+細(xì)胞。

1.5TCRv 24+v 11+NKT的檢測(cè)采用三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NKT細(xì)胞。取2根12 mm×75 mm流式試管分別標(biāo)記同型對(duì)照和測(cè)試管；吸取10 l CD3-PECy5至試管底部，在對(duì)照管中加入IgG1-FITC、IgG2a-PE各20 l，在測(cè)試管中加入V 24-FITC、V 11-PE各20l；每管中均加入100 l細(xì)胞密度為5×106/ml的PBMNC，漩渦振蕩混勻后避光室溫孵育15min；每管中加入PBS 2ml混勻；置水平離心機(jī)350 r/min室溫離心5 min；棄上清，加0.5 mlPBS重懸細(xì)胞、待測(cè)。以SSC/FSC結(jié)合SSC/CD3設(shè)門圈定CD3+細(xì)胞分析其中V 24+V 11+占CD3+的百分比即為NKT細(xì)胞的水平。每個(gè)測(cè)試至少檢測(cè)100 000個(gè)CD3+細(xì)胞。

1.6Th1/Th2細(xì)胞因子譜分析受試者采集不抗凝靜脈血3 ml靜置，待血清析出后置800 r/min離心機(jī)離心5 min，收集血清至1 mlEppendorf管并做好標(biāo)簽，置-76℃超低溫冰箱保存。檢測(cè)時(shí)將標(biāo)本置37℃水浴箱，采用CBA Human Th1/Th211plex試劑盒測(cè)定11種細(xì)胞因子（IL-12p70、IL-10、IL-2、IL-8、IL-6、IL-5、IL-4、IL-1b、IFN-、TNF-和TNF-），按說明書要求進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS16.0和Graph Pad Prism4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，兩組比較采用檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；相關(guān)分析采用線性回歸法。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ITP患者和健康對(duì)照者外周血RP水平慢性ITP組外周血RP的比例為（10.08±3.33）％，高于健康對(duì)照組（［1.82± 0.26）％，=2.474，＜0.05］（封三彩圖4）。Plt＜20×109/L的慢性ITP患者組RP為（17.53±7.56）％，顯著高于健康對(duì)照組和Plt＞20×109/L組（［4.95±1.37）％，=5.48，均＜0.05］，而后兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

2.2ITP患者和健康對(duì)照者外周血NKT細(xì)胞水平慢性ITP組PBMNCs 中NKT細(xì)胞的比例為（0.13±0.03）％，對(duì)照組為（0.09±0.03）％，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.845，＞0.05）（封三彩圖5）。Plt＜20×109/L的慢性ITP患者組NKT為（0.22±0.05）％，顯著高于健康對(duì)照組的和Plt＞20×109/L組（［0.05±0.01）％，=7.27，均＜0.05］，而后兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

2.3ITP患者和健康對(duì)照者外周血Tregs細(xì)胞水平慢性ITP組外周血Tregs細(xì)胞占CD4細(xì)胞的（3.97±0.44）％，對(duì)照組為（3.70±0.31）％，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.50，＞0.05）（封三彩圖6）。Plt ＜20×109/L慢性ITP組（［4.21±0.67）％］，Plt＞20×109/L組（［3.78±0.60）％］及對(duì)照組Tregs細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.24，＞0.05）。

2.4ITP患者和健康對(duì)照者血清Th1/ Th2細(xì)胞因子水平兩組在11種血清細(xì)胞因子水平上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≤1.67，均＞0.05）（表1）。慢性ITP組和對(duì)照組Th1/Th2型細(xì)胞因子比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（3.77±1.346.67± 3.45，=0.94，＞0.05）；1型/2型細(xì)胞因子比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（3.14±1.07 4.23±1.48，=0.60，＞0.05）。Plt＞20×109/L的慢性ITP組血清IFN-、IL-12p70、IL-4及TNF-水平要高于另外兩組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≤1.29，均＞0.05）（表2）。Plt＜20×109/L的慢性ITP組（3.14±1.20）、Plt＞20×109/L組（4.26±2.21）及對(duì)照組Th1/Th2型細(xì)胞因子比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.48，＞0.05）；3組1型/2型細(xì)胞因子比值分別為3.02±1.05、3.25±1.76及4.23±1.48，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.18，＞0.05）。

2.5ITP患者外周血NKT、Tregs、細(xì)胞因子與Plt的關(guān)系慢性ITP患者外周血Plt與NKT細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（=-0.373，=0.033）。Tregs和NKT細(xì)胞間無相關(guān)關(guān)系，但Tregs細(xì)胞與Th1/Th2細(xì)胞因子比值間呈正相關(guān)關(guān)系（=0.451，=0.011）。同時(shí)，Plt與血清IL-12p70、IFN、IL-4及TNF水平也呈正相關(guān)（= 0.354、0.365、0.354、0.366，均＜0.05）。

表1　慢性ITP組和對(duì)照組血清細(xì)胞因子表達(dá)水平pg/ml

表2　不同Plt數(shù)的慢性ITP患者和健康對(duì)照細(xì)胞因子表達(dá)水平pg/ml

3　討論

ITP的發(fā)病機(jī)制涉及機(jī)體失去對(duì)自身血小板抗原的外周耐受從而導(dǎo)致自體免疫細(xì)胞識(shí)別自身血小板抗原、產(chǎn)生自身反應(yīng)性T細(xì)胞和自身抗體，最后導(dǎo)致血小板的異常破壞。目前認(rèn)為NKT和 Tregs細(xì)胞是機(jī)體維持外周耐受最為重要的兩種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。

Johannson等［7］發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血NKT細(xì)胞的增殖潛力顯著減低，因此認(rèn)為NKT細(xì)胞在ITP發(fā)病中發(fā)揮重要作用。Johannson等［8］在1例女性ITP患者中發(fā)現(xiàn)外周血NKT細(xì)胞的顯著增高，并且這種增加的NKT細(xì)胞能夠抑制自體CD4+細(xì)胞的體外增殖活性，推測(cè)NKT細(xì)胞對(duì)ITP患者起保護(hù)作用。這一觀點(diǎn)得到Ho等［9］的支持。本研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者外周血NKT細(xì)胞數(shù)量依血小板數(shù)量減少程度的不同而有顯著差異，即Plt＜20×109/L的慢性ITP患者組NKT細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組和Plt＞20×109/L組，且ITP患者外周血NKT細(xì)胞與Plt呈負(fù)相關(guān)（=-0.373，=0.033）。

NKT和Tregs細(xì)胞在體內(nèi)相互影響對(duì)方的功能。Azuma等［10］發(fā)現(xiàn)，Tregs細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸機(jī)制抑制CD4+和CD4-CD8-NKT細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子（IFN-，IL-4，IL-13，IL-10）分泌和細(xì)胞毒活性，而NKT細(xì)胞、尤其是CD4+NKT細(xì)胞通過分泌IL-2促進(jìn)Tregs細(xì)胞的增殖［11］。本研究未發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞和Tregs細(xì)胞間的關(guān)系。血清細(xì)胞因子分析顯示，ITP患者和健康對(duì)照組在血清IL-12p70、IL-10、IL-2、IL-8、IL-6、IL-5、IL-4、IL-1b、IFN-、TNF-和TNF-水平，Th1/Th2細(xì)胞因子比值（反應(yīng)抗原特異性免疫反應(yīng)Th0細(xì)胞極化方向）和1型/2型細(xì)胞因子比值（反應(yīng)機(jī)體總體免疫反應(yīng)性質(zhì)）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05），推測(cè)可能與檢測(cè)標(biāo)本間結(jié)果數(shù)據(jù)的離散度太大有關(guān)。但相關(guān)分析表明，ITP患者血小板數(shù)量與IL-12p70、IFN-、IL-4及TNF-呈正相關(guān)，即細(xì)胞因子在ITP中發(fā)揮作用的觀點(diǎn)。由于ITP的診斷仍是排除性的［12］，加之疾病本身的異質(zhì)性，因此很多的研究結(jié)果之間很難進(jìn)行有效的比較。正如Zehnder等［13］認(rèn)為，對(duì)血小板抗原特異性T和B細(xì)胞進(jìn)行可靠識(shí)別和定量是今后ITP研究的方向之一。相應(yīng)地，結(jié)合血小板抗原特異性T和B細(xì)胞進(jìn)行NKT、Tregs及細(xì)胞因子表達(dá)譜分析將會(huì)極大地提高相關(guān)研究的可靠性。

［1］Cines DB，Blanchette VS.Immune thrombocytopenicpurpura［J］.NEnglJMed，2002，346（13）：995-1008.

［2］Panitsas FP，Theodoropoulou M，Kouraklis A，et al.Adult chronic idiopathicthrombocytopenic purpura（ITP）is the manifestationofatype-1polarizedimmuneresponse ［J］.Blood，2004，103（7）：2645-2647.

［3］WangTT，ZhaoH，RenH，etal.Type1and Type 2 T-cell profiles in idiopathic throm bocytopenic purpura［J］.Haematologica，2005，90（7）：914-923.

［4］Zhang J，Ma DX，Zhu XJ，et al.Elevated profileofTh17，Th1andTc1cellsinpatients with immune thrombocytopenic purpura ［J］.Haematologica，2009，94（9）：1326-1328.

［5］Cava AL，Kaer LV，F(xiàn)u-Dong-Shi.CD4+CD25+Tregs and NKT cells：regulators regu lating regulators［J］.Trends Immunol，2006，27（7）：322-327.

［6］Zhang L，Li H，Zhao H，et al.Hepatitis C virus-relatedadultchronicidiopathicthrombocytopenicpurpura：experiencefromasingle Chinesecenter［J］.EurJHaematol，2003，70 （3）：196-197.

［7］JohanssonU，MaceyMG，KennyD，et al. a-Galactosylceramide-driven expansion of humannatural killerT cellsisinhibitedby prednisolone treatment［J］.Br J Haematol，2004，125（3）：400-404.

［8］JohanssonU，MaceyMG，KennyD，et al. Therole of natural killer T（NKT）cells in immunethrombocytopenia：isstronginvitroNKT cell activityrelatedtothe develop-ment of remission［J］？Br J Haematol，2005，129（4）：564-565.

［9］HoLP，UrbanBC，JonesL，etal.CD4-CD8 alphaalpha subset of CD1d-restricted NKT cellscontrolsT cell expansion［J］.JImmunol，2004，172（12）：7350-7358.

［10］Azuma T，Takahashi T，Kunisato A，et al. HumanCD4+CD25+RegulatoryTCells Suppress NKT Cell Functions［J］.Cancer Res，2003，63（15）：4516-4520.

［11］Jiang S，Game，Davies D，et al.Activated CD1d-restrictednaturalkillerTcellssecrete IL-2：innate help for CD4CCD25C regulatory T cells［J］？Eur J Immunol，2005，35（4）：1193-1200.

［12］British Society for Haematology.Guidelinesfortheinvestigationandmanagement of idiopathic thrombocytopenic purpura inadults，children and in pregnancy［J］.Br J Haematol，2003，120（4）：574-596.

［13］Zehnder JL，Semple JW，Imbach P，et al. Future research in ITP：an ICIS consensus ［J］.Ann Hematol，2010，89：S19-S23.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.08.048

R554+.6；R558+.2

A

1671-0800（2016）08-1069-04

2016-05-15

（本文編輯：孫海兒）

316100浙江省舟山，舟山市普陀區(qū)人民醫(yī)院（邵鳳）；寧波開發(fā)區(qū)中心醫(yī)院（徐瑞龍）；金華市中心醫(yī)院（鄭昭璟、馬擁軍、胡少龍）

徐瑞龍，Email：ruilongxu@sina.com