miR-206對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及其機制

周　靜　張保朝

(南陽市中心醫院腦血管介入科，河南　南陽　473000)

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miR-206對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及其機制

周靜張保朝1

(南陽市中心醫院腦血管介入科，河南南陽473000)

目的探討 miR-206 對膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機制。方法通過實時定量 RT-PCR檢測膠質瘤組織、正常成人腦組織、膠質瘤細胞系U87和U251以及正常人腦膠質細胞(HEB)中miR-206的表達情況。通過脂質體轉染構建miR-206穩定過表達細胞系U87和U251，體外實驗研究 miR-206對膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響。通過miRNA靶基因預測數據庫預測miR-206的靶基因，并利用熒光素酶報告基因實驗檢測miR-206對14-3-3ζ的靶向作用。結果miR-206在膠質瘤組織和膠質瘤細胞系中具有較高的表達率。體外實驗顯示，miR-206抑制膠質瘤細胞的增殖，促進凋亡。靶基因預測分析14-3-3ζ為miR-206潛在的靶基因，熒光素酶實驗進一步證實14-3-3ζ是miR-206的直接靶點。結論miR-206可能通過靶向14-3-3ζ抑制膠質瘤細胞增殖，促進凋亡，可能是膠質瘤治療的新靶點。

miR-206；膠質瘤；增殖；凋亡

miRNAs與腫瘤發生有關〔1〕。膠質瘤是最常見的原發性腦腫瘤，具有發病率高、復發率大、死亡率高等特點〔2〕。Zhang等〔3〕報道了抑制miR-221/222基因簇的表達，能夠降低膠質瘤細胞的生長速度。miR-21、miR-125b、miR-181a和miR-181b等也被報道能夠影響膠質瘤細胞的增殖和凋亡〔1，4〕。miR-206作為新發現的 miRNA 在多種腫瘤中發揮重要的調節作用〔5〕。但是miR-206對膠質瘤細胞的影響尚未報道。本研究擬分析miR-206對膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響及其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1臨床資料2015年1～6月在我院腫瘤科確診為膠質瘤并且進行手術治療的患者15例，術前均未進行放化療。所有組織離體后直接投入液氮中貯存備用。患者年齡60～80歲，平均65.2歲。樣品的采集均經患者以及家屬的知情同意。

1.2細胞系、載體及試劑人膠質母細胞瘤U87和U251細胞系以及正常人腦膠質細胞(HEB)均從中國科學院上海細胞生物學研究購得。青霉素、鏈霉素(Sigma公司，美國)，RPMI1640培養基、胎牛血清(FBS，Gibco BRL公司，美國)，pGL3質粒(Promega 公司，美國)，Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司，美國)，miR-206模擬物及對照購自西安沃爾森生物技術有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ和Lipofectamine 2000轉染試劑盒均購自美國GeneCopoeia公司；Ki67、Bcl-2、Caspase-3、p-caspase-3、14-3-3ζ和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體，以及辣根過氧化物酶標記二抗均購自英國Abcam公司；Gene TailorTMSite-Directed Mutagenesis System試劑盒(Invitrogen公司，美國)Dual-Luciferase Reporter System(Biovision公司，美國)。

1.3方法

1.3.1細胞培養將U87和U251膠質瘤細胞株置于含10%的胎牛血清、鏈霉素 100 μg/ml、青霉素100 U/ml的RPMI1640 培養液中37℃，5% CO2飽和濕度貼壁培養。單層細胞生長達到70%～80% 融合時，進行胰蛋白酶消化，然后以600 r/min 5 min離心傳代后繼續培養。取對數期活力良好的細胞進行實驗。

1.3.2RT-PCR檢測嚴格按照Trizol使用說明書提取組織和細胞中的總RNA，并用紫外分光光度法進行定量。接著按照PrimeScript RT Reagent Kit使用說明，合成miR-206的cDNA，反應條件是95℃，3 min (1個循環)，95℃、12 s，61℃、40 s(38個循環)。實施定量PCR的反應按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ使用說明，反應程序為95℃、10 min預期變性，95℃、10 s，59℃、30 s(40個循環) 。以U6 為內參基因，分析miR-206在不同組織和細胞中的相對表達水平。

1.3.3細胞轉染選取對數期生長狀態良好的U87和U251細胞，以2×105/孔的密度分別接種于6孔培養板中，孔中均加入不含抗生素的培養液。培養24 h，細胞融合度達到30%～50%。然后按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行轉染，將miR-206模擬物對照(miR-control)和miR-206模擬物(miR-206 mimics)轉染至U87和U251細胞內，培養24 h后更換新鮮的培養液。

1.3.4噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖取生長良好的U87和U251轉染miR-206模擬物的實驗組及對照組細胞，以3×104/孔的密度接種于96孔板后加入DMEM培養基。培養周期4 d，每天按時檢測，檢測時，每孔先加入20 μl (5 g/L)的MTT溶液，繼續孵育4 h，然后換液，每孔加入150 μl二甲亞砜，放入搖床中輕微振蕩直至完全溶解MTT轉化生成的紫色甲臜。之后用酶標儀檢測各孔在570 nm處的吸光度。

1.3.5流式細胞儀檢測細胞凋亡取生長良好的U87和U251轉染miR-206模擬物和模擬物對照的細胞用于實驗。實驗嚴格按照Annexin-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，將細胞加入100 μl 1倍上樣緩沖液重懸，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)染料，避光，振蕩混勻，室溫反應10 min。再次加入400 μl 1倍上樣緩沖液，混勻。然后用流式細胞儀檢測，統計發生早期凋亡的細胞數目。

1.3.6免疫印跡提取各細胞樣本的總蛋白，定量，使用10%的分離膠電泳。冰浴下100 V轉膜2 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相對應的一抗4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，10 min/次。加入二抗，37℃孵育1 h，TBST洗滌3 次，15 min/次，在暗室中進行壓片，然后顯影、定影。

1.3.7miR-206靶基因預測MICROCOSM，TargetScan和PicTar 3個miRNA靶基因預測數據庫對miR-206的靶基因進行預測。

1.3.8熒光素酶實驗將14-3-3ζ 3′UTR的PCR擴增產物連接到pGL3質粒Xbal酶切位點，構建pGL3-WT-14-3-3ζ(野生型)報告基因質粒。通過GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System 試劑盒，突變14-3-3ζ 3′UTR 序列內的結合位點，構建pGL3-MUT-14-3-3ζ真核表達載體(突變型)。取U251細胞分別轉染為以下幾組，①14-3-3ζ 野生型質粒：對照組(轉染野生型14-3-3ζ質粒和miR-206模擬物對照)、實驗組(轉染野生型14-3-3ζ質粒和miR-206模擬物)。②14-3-3ζ突變型質粒：對照組(轉染突變型14-3-3ζ質粒與miR-206模擬物對照)、實驗組(轉染突變型14-3-3ζ質粒與miR-206模擬物)。細胞轉染24 h后，采用Dual-Luciferase Reporter System，檢測熒光素酶活性。

1.4統計學方法采用GraphPad Prism 5軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1miR-206在膠質瘤組織和細胞中低表達RT-PCR結果顯示，miR-206在膠質瘤組織中的表達水平(0.38±0.05)顯著低于正常人腦組織(設為1)(P<0.05)。在人膠質母細胞瘤U87和U251細胞系中的表達水平(0.40±0.04，0.48±0.06)也顯著低于HEB(P<0.05)。

2.2外源性增加miR-206抑制膠質瘤細胞增殖轉染miR-206的U87和U251細胞的增殖速度明顯低于對照組(P<0.05)。轉染miR-206的U87和U251細胞中Ki67蛋白的表達水平(0.42±0.05、0.33±0.04)顯著低于對照組(設為1)(P<0.05)。見圖1。

圖1　U87和U251中miR-206上調對細胞增殖的影響

2.3外源性增加miR-206促進膠質瘤細胞凋亡轉染miR-206的U87和U251細胞的凋亡率〔(21.32±2.15)%,(16.58±2.64)%〕明顯高于對照組〔(2.87±0.89)%,(3.27±1.08)%〕(P<0.05)，表明外源性增miR-206促進膠質瘤細胞凋亡。轉染miR-206的U87和U251細胞中Bcl-2蛋白的表達水平(0.28±0.04,0.33±0.05)相比于對照組(設為1)明顯降低，Caspase-3的表達水平(0.92±0.08,1.05±0.09)沒有明顯變化，而p-Caspase-3的表達水平(2.15±0.25,19.8±0.21)則出現了顯著的升高，這也表明了外源性增加miR-206促進膠質瘤細胞凋亡。見圖2。

圖2　U87和U251中miR-206上調對細胞凋亡的影響

圖3　miR-206直接靶向14-3-3ζ

2.4miR-206直接作用于14-3-3ζ將MICROCOSM、TargetScan和PicTar 3個miRNA靶基因預測數據庫所得到的預測結果比對之后，選取被三者都預測得到的靶基因作為備選，進而選得14-3-3ζ為靶基因。14-3-3ζ mRNA的3′UTR與miR-206的種子區存在理論上的互補匹配序列，見圖3。如圖3所示，熒光素酶實驗顯示共轉染14-3-3ζ野生型的實驗組中，熒光素酶活性(0.46±0.06)與對照組(設為1)相比明顯下降(P<0.05)；而共轉染MET突變型的實驗組(0.95±0.09)與對照組(1.05±0.08)的熒光素酶活性無顯著差異，熒光素酶實驗證實miR-206可以直接靶向14-3-3ζ。進一步研究結果顯示，轉染miR-206的U87和U251細胞中14-3-3ζ蛋白的表達水平(0.42±0.05,0.58±0.08)顯著低于對照組(設為1)(P<0.05)。

3　討　論

膠質瘤是神經系統最常見的惡性腫瘤，占顱內原發腫瘤的46%，其預后差，即使行聯合手術、放化療等，病人的平均生存期也僅為診斷后的9～12個月〔6〕。膠質瘤的發生、發展是一個復雜的過程。miRNA調控人體60%的蛋白編碼基因〔7〕。Xia等〔4〕報道了miR-125通過靶向Bmf影響膠質瘤細胞的增殖和凋亡。Shi等〔1〕報道了hsa-miR-181a和hsa-mir-181b能夠抑制膠質瘤的發生。Zhang等〔3〕證實了抑制miR-221/222基因簇的表達，降低了膠質瘤細胞的生長速度。miR-206已經被報道與腫瘤的發生有關〔5〕。Wang等〔8〕報到了miR-206能夠調節神經細胞的增殖和凋亡。但是關于miR-206對膠質瘤的發生、發展是否有影響，目前尚未有報道。本研究發現miR-206在膠質瘤組織和人膠質母細胞瘤U87和U251細胞系中有一個較高的表達水平。體外研究也發現外源性增加miR-206抑制膠質瘤細胞增殖、促進凋亡。

14-3-3ζ蛋白在多種癌癥中過表達，包括腦腫瘤，被普遍認為是癌癥發生的一個致癌基因〔9～11〕。14-3-3ζ存在于多種組織、器官中，例如腎上腺、腸、肝等，尤其在腦中的含量較為豐富，主要位于神經源性成分中，與膠質瘤的發生、發展以及預后都有一定的關系〔12〕。本研究推測miR-206可能通過靶向14-3-3ζ抑制膠質瘤細胞的增殖，促進凋亡。

膠質瘤的發生是一個多因素、多步驟、多階段的復雜過程。miR-206的功能分析顯示其能夠抑制膠質瘤細胞的增殖，促進凋亡，而且能夠直接靶向與膠質瘤發生、發展以及預后都有一定關系的14-3-3ζ蛋白。這為以后深入研究miR-206-14-3-3ζ對膠質瘤生物學特性的影響奠定了理論基礎，同時也為今后研究膠質瘤的診斷、治療以及預后提供了新靶點。

1Shi L，Cheng Z，Zhang J，etal.hsa-mir-181a and hsa-mir-181b function as tumor suppressors in human glioma cells〔J〕.Brain Res,2008；1236(2)：185-93.

2Hwang JH，Smith CA，Salhia B，etal.The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells〔J〕.Neoplasia,2008；10(2)：149-59.

3Zhang C，Kang C，You Y，etal.Co-suppression of miR-221/222 cluster suppresses human glioma cell growth by targeting p27kip1 in vitro and in vivo〔J〕.Int J Oncol,2009；34(6)：1653-60.

4Xia HF，He TZ，Liu CM，etal.MiR-125b expression affects the proliferation and apoptosis of human glioma cells by targeting Bmf〔J〕.Cell Physiol Biochem，2009；23(4-6)：347-58.

5Zhang L，Xia L，Zhao L，etal.Activation of PAX3-MET pathways due to miR-206 loss promotes gastric cancer metastasis〔J〕.Carcinogenesis,2015;36(3):390-9.

6趙學英.RNAi沉默Livin基因對裸鼠移植瘤生長及Ki67蛋白表達的影響〔J〕.臨床和實驗醫學雜志,2015；14(5)：352-5.

7葉振南，徐善水.miRNA 在膠質瘤組織和細胞中的表達及作用〔J〕.山東醫藥，2013；53(33)：100-2.

8Wang R，Hu Y，Song G，etal.MiR-206 regulates neural cells proliferation and apoptosis via Otx2〔J〕.Cell Physiol Biochem,2012；29(3-4)：381-90.

9Friedman RC，Farh KK，Burge CB，etal.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs〔J〕.Genome Res,2009；19(1)：92-105.

10Ralhan R，Masui O，DeSouza LV，etal.Identification of proteins secreted by head and neck cancer cell lines using LC-MS/MS：strategy for discovery of candidate serological biomarkers〔J〕.Proteomics,2011；11(12)：2363-76.

11Ko BS，Lai IR，Chang TC，etal.Involvement of 14-3-3γ overexpression in extrahepatic metastasis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Hum Pathol,2011；42(1)：129-35.

12Yan Y，Xu Y，Gao YY，etal.Implication of 14-3-3ε and 14-3-3θ/τ in proteasome inhibition-induced apoptosis of glioma cells〔J〕.Cancer Sci,2013；104(1)：55-61.

〔2016-03-24修回〕

(編輯袁左鳴)

河南省科技廳科技攻關項目(No.112102310173)

張保朝(1963-)，男，碩士生導師，主任醫師，主要從事神經內科疾病研究。

周靜(1979-)，女，碩士，主治醫師，主要從事膠質瘤的研究。

R739.41

A

1005-9202(2016)15-3739-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.060

1南陽市中心醫院神經內科