外源端粒酶逆轉錄酶基因對老年大鼠供肝缺血再灌注損傷的影響

王　鑫　王忠臣　黃智勇

(大慶龍南醫院普外科，黑龍江　大慶　163000)

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外源端粒酶逆轉錄酶基因對老年大鼠供肝缺血再灌注損傷的影響

王鑫王忠臣黃智勇

(大慶龍南醫院普外科，黑龍江大慶163000)

目的探討外源端粒酶逆轉錄酶基因對老年大鼠供肝缺血再灌注損傷的影響。方法SD大鼠分為端粒酶催化亞基(hTERT)干預組(n=25)、空轉載體組(n=5)、生理鹽水組(n=25)3組，取肝前2 d自頸背給予hTERT干預組供者靜脈注射1 ml 3×109pfu/ml攜帶hTERT的病毒懸液，給予空轉載體組供者靜脈注射1 ml 3×109pfu/ml空病毒懸液，給予生理鹽水組供者靜脈注射1 ml生理鹽水。結果再灌注后3、6、12 h，1、2 d hTERT組血清谷氨酸轉氨酶(ALT)水平均顯著低于空轉載體組和生理鹽水組(P<0.05)，凋亡陽性細胞均顯著少于空轉載體組和生理鹽水組(P<0.05)，凋亡指數也均顯著低于空轉載體組和生理鹽水組(P<0.05)；轉染1 d后hTERT組肝細胞端粒酶活性顯著高于陰性對照組和陽性對照組(P<0.05)。結論外源端粒酶逆轉錄酶基因能夠有效防護老年大鼠供肝缺血再灌注損傷。

外源端粒酶逆轉錄酶基因；供肝缺血再灌注損傷

肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)的一個極為重要的表現就是細胞凋亡，組織產生的氧自由基在再灌注的情況下會對肝細胞進行誘導使其發生凋亡〔1〕。目前國內外研究的一個熱點就是采取何種方法最大限度地降低缺血再灌注引發的移植肝細胞凋亡程度。現階段，基因重組技術已經得到了應用，對Bcl-2、HO-1等進行構建表達，對凋亡基因的質粒進行抑制并向小動物肝移植供者體內導入，但是將目的基因設定為端粒酶的研究還沒有出現〔2〕。本研究對肝移植缺血再灌注損傷中人端粒酶催化亞基(hTERT)基因的作用進行探討。

1　材料與方法

1.1實驗材料采用黑龍江省實驗動物中心提供的SD大鼠，本實驗室自行構建表達外源性hTERT的重組復制缺陷性腺病毒，經Pme I酶切線性化攜帶目的基因的質粒后向細菌中轉入，并同源重組其和細菌中含腺病毒基因骨架的質粒AdEasy。經Pac I酶切重組質粒Ad-hTERT后對293細胞進行轉染，包裝成腺病毒顆粒，并大量擴增及純化。同時將空載體病毒AdEasy質粒構建，擴增、氯化銫梯度離心后對病毒滴度進行測定，保存在-80℃的溫度下備用。購買美國Allied Biotech Inc公司生產的端粒酶檢測試劑盒和美國Boehinger Mannheim公司生產的TUNEL試劑盒。

1.2實驗分組將SD大鼠分為hTERT干預組(n=25)、空轉載體組(n=5)、生理鹽水組(n=25)3組，取肝前2 d自頸背給予hTERT干預組供者靜脈注射1 ml 3×109pfu/ml攜帶hTERT的病毒懸液，給予空轉載體組供者靜脈注射1 ml 3×109pfu/ml空病毒懸液，給予生理鹽水組供者靜脈注射1 ml生理鹽水。在肝臟保存(UW)液中放置切取的供肝，進行6 h的修整保存后向同種大鼠移植。移植后3、6、12 h、1、2 d，分別取材對ALT、端粒酶活性等進行檢測。

1.3實驗方法①運用二袖套法建立大鼠肝移植模型；②抽取下腔靜脈血，取上清液，采用全自動生化分析儀對谷氨酸轉氨酶(ALT)含量進行測定；③將20 mg目的基因轉染的供肝組織與20 mg對照組供肝組織取出，采用美國Allied Biotech Inc公司生產的Telomerase PCR ELISA試劑盒檢測端粒酶活性，操作過程中嚴格依據試劑盒說明書進行；④免疫印跡法的操作步驟為：應用蛋白裂解液將肝組織裂解，-4℃離心將上清取出，上樣電泳，轉膜，封閉，將一抗、二抗加入其中，顯色；⑤采用10%甲醛溶液將肝組織固定，HE染色前保證常規石蠟切片，然后在普通光鏡及電鏡下進行病理組織學觀察；⑥將規格為0.5 cm×0.5 cm的大鼠肝組織取出，在4%多聚甲醛中放置，進行1 d的固定后常規石蠟包埋，切成切片，切片厚度為5 μm，操作過程中嚴格依據試劑盒說明書進行。陽性標準為細胞核被染成棕黃色，高倍視野(×400)下將每張切片的5個視野選取出來，為每個視野肝細胞總數計數，同時為陽性肝細胞計數。

1.4統計學方法采用軟件SPSS20.0統計軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1再灌注后血清ALT水平比較再灌注后3、6、12 h hTERT組血清ALT水平均顯著低于空轉載體組和生理鹽水組(P<0.05)，但空轉載體組和生理鹽水組血清ALT水平差異均不顯著(P>0.05)。見表1。

表1　各組再灌注后各時點血清ALT水平比較±s)

與空轉載體組比較：1)P<0.05；與生理鹽水組比較：2)P<0.05；下表同

2.2再灌注后肝細胞端粒酶活性比較轉染1 d后hTERT組肝細胞端粒酶活性(32 500±500)顯著高于陰性對照組(22 500±500)和陽性對照組(2 500±500)(P<0.05)。

2.3免疫印跡檢測結果有顯著hTERT蛋白陽性條帶存在于hTERT組肝組織中，但是不存在于空轉載體組和生理鹽水組。見圖1。

2.4移植肝臟組織學檢查結果空轉載體組和生理鹽水組移植肝小梁結構均被嚴重破壞，有空泡樣變性及水腫出現在門靜脈周圍，電鏡檢測也發現有大量空泡出現在肝細胞內，線粒體腫脹嚴重。見圖2。

2.5肝細胞凋亡檢查結果再灌注后3、6、12 h，1、2 d hTERT組凋亡陽性細胞均顯著少于空轉載體組和生理鹽水組(P<0.05)，凋亡指數也均顯著低于空轉載體組和生理鹽水組(P<0.05)，但空轉載體組和生理鹽水組凋亡陽性細胞和凋亡指數差異均不顯著(P>0.05)，見表2、圖3。

圖1　各組肝組織中hTERT蛋白的表達情況

組別n3h6h12h1d2dhTERT組255.3±0.731)2)10.2±0.671)2)9.3±0.781)2)7.1±1.121)2)4.8±0.651)2)空轉載體組57.8±1.0515.9±1.8211.7±1.598.3±1.096.4±0.67生理鹽水組257.8±0.8315.9±1.5811.7±1.598.8±0.86.5±0.70

圖2　移植肝臟組織學檢查結果(×100)

圖3　再灌注后hTERT組、生理鹽水組肝細胞凋亡陽性細胞(×200)

3　討　論

在臨床病理及手術過程中，肝臟缺血再灌注損傷極易發生，其屬于一個復雜的病理過程，參與主體為多細胞，多種介質共同將作用發揮出來。細胞凋亡即細胞死亡，誘發因素為生理性等因素，不引發炎癥反應。很多疾病的發生過程均受到凋亡異常的直接影響。研究表明〔3〕，細胞凋亡和缺血再灌注損傷具有極為密切的關系，在HIRI的病理過程中，凋亡可能發揮著極為重要的作用。相關醫學學者研究表明〔4〕，向大腦皮層轉染缺陷型單純皰疹病毒載體(載有抗凋亡基因bcl-2)后bcl-2基因表達顯著，同時能夠有效保護表達部位神經。現階段，已有相關醫學學者在對大鼠等bcl-2高表達的轉基因動物進行建立的過程中將轉基因技術充分利用，同時在缺血再灌注損傷的動物模型的建立過程中將該動物充分利用，研究結果顯示和正常動物相比，該轉基因動物具有顯著較強的組織損傷程度〔5〕。研究證實〔6〕，衰老進程由端粒長度控制，對衰老進行觸發的分子鐘為端粒縮短。在大部分正常的人體細胞中并無法對端粒酶活性進行檢測，隨著細胞分裂，端粒會丟失，丟失頻率為每次50～200個堿基。研究表明〔7〕，發生這一現象的原因為正常的人體細胞中端粒酶沒有被活化。正常體細胞的增殖能力可能在保護性端粒酶的作用下受到了最終制約。細胞在幾千個堿基的端粒DNA丟失后就會停止分裂而衰老，并最終引發細胞凋亡。如果體外給予適量端粒酶，則會對細胞凋亡進行有效防止，進而促進細胞增殖能力的顯著增強。研究表明〔8〕，向正常的細胞中導入端粒酶基因會造成端粒酶表達異常。異常延長的活化端粒酶序列會在極大程度上增加細胞壽命。本研究結果提示外源端粒酶逆轉錄酶基因能夠有效防護老年大鼠供肝缺血再灌注損傷。

1吳靈芝，李水彬，程剛衛，等.hTERT基因轉染對人神經元活力的影響〔J〕.贛南醫學院學報，2014；34(2)：170-3.

2靳斌，王偉，劉澤陽，等.外源hTERT基因轉染對老年大鼠供肝缺血再灌注損傷的防護作用〔J〕.山東大學學報(醫學版)，2013；51(8)：13-6.

3劉曉麗，馬禮鴻，王凱.Bmi-1和hTERT在胃癌組織中的表達及臨床病理意義〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(19)：4694-5.

4李金丫，左靜，劉亮，等.食管癌高發區人群咬檢組織中hTERT蛋白的表達及其臨床意義〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(4)：713-4.

5Guo L，Li P，Meng CY，etal.Protective effect of zinc on mouse renal ischemia-reperfusion Injury by anti-apoptosis and antioxidation〔J〕.Curr Pharmac Biotechnol，2014；15(6)：577-82.

6Chahine N，Makhlouf H，Duca L，etal.Cardioprotective effect of saffron extracts against acute doxorubicin toxicity in isolated rabbit hearts submitted to ischemia-reperfusion injury〔J〕.Zeitschriftfür Naturforschung C，2015;69(9-10)：459-70.

7Alhejily W，Aleksi A，Martin BJ，etal.The effect of ischemia-reperfusion injury on measures of vascular function〔J〕.Clin Hemorheol Microcirc，2014L；56(3)：265-71.

8Zhu SH，Zhou LJ，Jiang H，etal.Protective effect of indomethacin in renal ischemia-reperfusion injury in mice〔J〕.J Zhejiang Univ Sci B，2014；15(8)：735-42.

〔2015-02-19修回〕

(編輯苑云杰)

王鑫(1981-)，男，主治醫師，主要從事普外科疾病研究。

R53.3

A

1005-9202(2016)15-3660-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.022