氧化低密度脂蛋白對動脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血Treg細胞的影響

胡曉雁　魏建宏　任　旭　劉晗睿　琚小紅　段圣杰　肖志杰

(長治醫學院附屬和濟醫院神經內科，山西　長治　046011)

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氧化低密度脂蛋白對動脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血Treg細胞的影響

胡曉雁魏建宏1任旭劉晗睿琚小紅段圣杰肖志杰2

(長治醫學院附屬和濟醫院神經內科，山西長治046011)

目的探討動脈粥樣硬化性腦梗死(ACI)患者外周血Treg細胞比例變化及氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)對外周血Treg細胞凋亡的影響。方法流式細胞術分析ACI患者外周血Treg細胞比例；根據患者性別、年齡、有無高血壓、糖尿病和血脂異常進行分組，比較不同組別ACI患者外周血Treg細胞比例的差異；對ACI患者外周血Treg細胞比例與患者外周血Ox-LDL水平進行相關性分析；凋亡染色確定Ox-LDL對Treg細胞凋亡的影響。結果ACI患者外周血Treg細胞比例與對照組相比顯著降低(P<0.01)；ACI患者外周血Treg細胞百分比在不同性別、年齡、有無高血壓、糖尿病和血脂異常組間均無統計學意義(P>0.05)；ACI患者外周血Treg細胞百分比與患者外周血Ox-LDL水平呈明顯的負相關(r2=0.500 5；P<0.01)；Ox-LDL可誘導Treg細胞出現凋亡，且隨著Ox-LDL濃度的升高，凋亡細胞百分比逐漸升高。結論Ox-LDL可通過誘導Treg細胞凋亡進而導致ACI患者外周血Treg細胞比例降低。

低密度脂蛋白；動脈粥樣硬化；腦梗死；外周血；調節性T細胞

動脈粥樣硬化(AS)性腦梗死(ACI)患者外周血Treg細胞比例存在明顯的異常〔1〕。氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是導致AS發病的關鍵因素，并可通過多種機制導致斑塊破裂和血栓形成〔2〕。目前，關于Ox-LDL是否可通過影響調節性T細胞(Treg細胞)的凋亡情況而導致ACI患者外周血Treg細胞比例降低還很少有報道。本文旨在探討Ox-LDL對Treg細胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1資料2013年1月至2014年12月在我院神經內科住院的ACI患者及同期住院健康體檢者各45例。ACI患者平均年齡(61.9±12.3)歲，其中男30例，女15例。對照組平均年齡(62.1±13.1)歲，其中男30例，女15例。ACI患者均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準。患者入組前均為接受任何免疫抑制劑和類固醇的治療。排除全身感染者、嚴重心腎功能不全等患者。

1.2Treg細胞比例檢測Picoll密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞(PBMC)。獲取的PBMC以含1%胎牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，隨后加入異硫氰酸熒光素(FITC)-CD4抗體；4℃孵育30 min；以含1%BSA的PBS洗滌2次。上述細胞中加入0.5 ml的Foxp3染色固定破膜液，室溫避光放置30 min；以Foxp3染色透化液洗滌2次，加入APC-Foxp3抗體，室溫避光放置30 min；以Foxp3染色透化液洗滌2次。0.1 ml含1%BSA的PBS重懸細胞進行檢測。

1.3外周血Treg細胞獲取方法Picoll密度梯度離心法獲取的健康人PBMC采用美天旎公司的外周血Treg細胞分選試劑盒分選獲取純度>90%的Treg細胞。具體操作方法參見試劑盒說明書。

1.4Ox-LDL處理Treg細胞上述獲取的Treg細胞采用不同濃度的Ox-LDL(0、10、50和100 μg/L)在體外處理48 h，隨后進行凋亡情況檢測。

1.5凋亡檢測采用Annexin V/7-AAD方法檢測細胞凋亡情況。具體操作方法參見試劑盒說明書。

1.6統計學方法采用Graphpad prism5.0軟件進行t檢驗和Pearson相關分析。

2　結　果

2.1患者外周血Treg細胞比例變化情況對照組外周血CD4+Foxp3+細胞百分比〔(10.14±2.34)%〕顯著高于ACI患者〔(3.92±0.69)%〕(P<0.01)。

2.2患者外周血Treg細胞比例與腦血管危險因素相關性分析ACI患者外周血CD4+Foxp3+細胞百分比在不同性別、年齡、有無高血壓、糖尿病和血脂異常組間無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　ACI患者外周血Treg細胞比例與腦血管危險因素相關性分析±s,%)

2.3患者外周血Treg細胞比例與患者外周血Ox-LDL水平相關性分析ACI患者外周血CD4+Foxp3+細胞百分比與患者外周血Ox-LDL水平呈明顯的負相關(r2=0.500 5；P<0.01)。見圖1。

圖1　ACI患者外周血Treg細胞比例與Ox-LDL水平相關性分析

2.4Ox-LDL對Treg細胞凋亡的影響對照組為(0.84±0.34)%，0 μg/L組凋亡細胞百分比為(2.01±0.68)%，10 μg/L組為(6.93±1.27)%，100 μg/L組為(16.90±3.83)%，隨著Ox-LDL濃度的升高，凋亡細胞百分比逐漸升高。

3　討　論

Ox-LDL與AS的發生和發展密切相關〔3〕。LDL在體內被氧化修飾為Ox-LDL后促發體內的一系列復雜的病理生理過程，在AS的發生、發展中具有重要的作用。余曉芳〔4〕證實Ox-LDL在AS、穩定型心絞痛和急性心肌梗死患者體內水平顯著高于健康對照組。同時，Wang等〔5〕也證實Ox-LDL在急性心肌梗死發生發展中具有重要的作用。ACI是腦部AS和血栓形成，使腦血管管腔狹窄或閉塞，導致急性腦供血不足，從而引起局部腦組織缺血性壞死。腦梗死的發生發展與頸動脈AS密切相關，使得Ox-LDL在ACI的發生、發展中具有重要的作用〔4〕。

Treg細胞是一種具有免疫抑制功能的細胞，Treg細胞在抗AS形成中的作用已得到肯定〔6〕。本研究結果與Li等〔1〕報道的ACI患者外周血Treg細胞百分比存在明顯的異常相一致。提示Treg細胞在ACI發生發展中具有一定的作用。另外Treg細胞百分比與患者性別、年齡、有無高血壓、糖尿病和血脂異常無相關性。且Ox-LDL可調節ACI患者外周血Treg細胞百分比。進一步的體外實驗結果顯示，Ox-LDL可明顯誘導Treg出現凋亡，隨著Ox-LDL濃度的升高，凋亡細胞百分比逐漸升高。

1Li Q,Wang Y,Yu F,etal.Peripheral Th17/Treg imbalance in patients with atherosclerotic cerebral infarction〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2013;6(6):1015-27.

2Mitra S,Deshmukh A,Sachdeva R,etal.Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy〔J〕.Am J Med Sci,2011;342(2):135-42.

3Steinberg D,Witztum JL.Is the oxidative modification hypothesis relevant to human atherosclerosis?Do the antioxidant trials conducted to date refute the hypothesis〔J〕？Circulation,2002;105(17):2107-11.

4余曉芳.氧化低密度脂蛋白抗體對動脈粥樣硬化診斷的臨床價值研究〔J〕.昆明醫學院學報，2010;31(5)：31-4.

5Wang TC,Hsu CC,Chin YP,etal.The autoantibody expression against different source of oxidized low density lipoprotein in patients with acute myocardial infarction〔J〕.Thromb Res,2002;107(3-4):175-9.

6Li Q,Wang Y,Li H,etal.Ox-LDL influences peripheral Th17/Treg balance by modulating Treg apoptosis and Th17 proliferation in atherosclerotic cerebral infarction〔J〕.Cell Physiol Biochem,2014;33(6):1849-62.

〔2015-12-27修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

山西省自然科學基金資助項目(2013011052-2)

肖志杰(1967-)，男，博士，教授，主要從事血脂代謝相關蛋白的基因多態性與腦卒中研究。

胡曉雁(1971-)，女，講師，主要從事血脂與動脈粥樣硬化研究。

R743

A

1005-9202(2016)15-3653-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.019

1山西醫科大學汾陽學院

2中南大學附屬湘雅二院