白細胞介素-17在卵清蛋白誘導的大鼠過敏性結(jié)膜炎發(fā)病中的作用

張　劍　王玉清　宿星杰　劉宏偉

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江　佳木斯　154002)

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白細胞介素-17在卵清蛋白誘導的大鼠過敏性結(jié)膜炎發(fā)病中的作用

張劍王玉清宿星杰劉宏偉

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江佳木斯154002)

目的探討白細胞介素(IL)-17在雞卵清蛋白(OVA)誘導的大鼠過敏性結(jié)膜炎(AC)發(fā)病中的可能作用。方法30只Brown Norway大鼠隨機分對照組(NC組)和AC組。應用OVA誘導大鼠AC模型。觀察兩組眼瞼和結(jié)膜充血、水腫、分泌物情況并做評分。對兩組眼球和上下眼瞼進行病理學分析,計數(shù)穹隆部眼結(jié)膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)。應用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定大鼠血清和脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素(IFN)-γ水平。結(jié)果AC組體征評分明顯高于NC組(P<0.01)。AC組眼結(jié)膜穹隆部嗜酸性粒細胞計數(shù)較NC組明顯升高(P<0.01)。AC組血清和脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10水平較NC組明顯升高(均P<0.01)，IFN-γ水平明顯降低(P<0.01)。結(jié)論IL-17 增高、Th1/Th2失衡是大鼠AC發(fā)病的重要原因，降低IL-17、恢復Th1/Th2失衡可能成為AC治療的一條新途徑。

過敏性結(jié)膜炎；T細胞；白細胞介素-17

有報道全世界患過敏性結(jié)膜炎(AC)者達20%，我國患病率約10%～16%〔1,2〕。研究表明AC是眼部結(jié)膜對外源特異性抗原發(fā)生的免疫應答，包括IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應和T 細胞介導的免疫反應〔3〕。近年研究發(fā)現(xiàn)機體T 細胞前體Th0能分化產(chǎn)生一種新型的17型輔助性T細胞，它不同于1型和2型T細胞，有獨特的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)機制，能產(chǎn)生特異性的效應因子白細胞介素(IL)-17，IL-17能強大招募中性粒細胞，促進多種細胞分泌釋放炎性因子，放大炎癥反應，參與多種免疫性炎癥疾病的病理過程〔4〕。本實驗探討IL-17在卵清蛋白(OVA)致敏的大鼠AC發(fā)病中的可能作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組由佳木斯大學實驗動物中心提供的SPF級，鼠齡6～8 w，Brown Norway大鼠30只，體重150～200 g，按隨機數(shù)字法分為對照組(NC組)10只，AC組20只。

1.2主要試劑及儀器OVA、Al(OH)3(美國Sigma公司)，Giemsa染色試劑(北京索萊寶科技有限公司)，臺吩藍(上海生工生物工程股份有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，大鼠變應原特異性IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素(IFN)-γ試劑盒(美國RD公司)，全自動酶標儀(Rayto RT-6000)。

1.3AC大鼠模型的制作AC組于實驗第1天給OVA 100 μg和佐劑Al(OH)35 mg磷酸鹽緩沖液(PBS)0.2 ml左后足底部注射，第7天給同樣OVA PBS液100 μg/0.2 ml腹腔注射。第14、16天給OVA PBS液(每眼750 μg/5 μl)點眼激發(fā)。NC組給予等量的PBS液，給藥時間和途徑同實驗組。

1.4眼部臨床評估在結(jié)膜囊OVA末次致敏后20 min，雙盲法裂隙燈顯微鏡觀察眼部體佂(均觀察右眼)。根據(jù)Magone等〔5〕的標準評分。評分四項指標為：結(jié)膜水腫、結(jié)膜充血、眼瞼充血水腫、流淚，分別計0～3分。結(jié)膜水腫評分標準：輕度局限結(jié)膜水腫1分；彌散水腫、穹隆部受累2分；結(jié)膜水腫致結(jié)膜嚢淺窄3分。結(jié)膜充血評分標準：輕度的彌散血管充血1分；彌散充血近穹隆部明顯2分；充血伴結(jié)膜下出血3分。眼瞼充血水腫評分標準：輕度眼瞼充血水腫1分；眼瞼彌散充血水腫瞼裂變小2分；眼瞼嚴重充血水腫、眼開困難3分。流淚評分標準：淚阜部淚液積存1分；淚液溢出瞼緣2分；流淚不止3分。最后將4項指標各自積分相加得出總分。

1.5眼部病理學檢測末次激發(fā)24 h斷髓法處死大鼠，摘取眼球及上、下眼瞼10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，矢狀位4 μm連續(xù)切片，Giemsa染色，觀察大鼠眼結(jié)膜病理變化。計數(shù)穹隆部結(jié)膜每高倍鏡下嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)。

1.6脾細胞培養(yǎng)摘取眼球及瞼結(jié)膜后，無菌條件下取出大鼠脾臟，經(jīng)100目鋼網(wǎng)研磨過濾成單個細胞，用RPMI1640培養(yǎng)基(含100 mg/L小牛血清、100 mg/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)重懸脾細胞。用8.3 g/L NH4Cl紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心，收集細胞沉淀。用RPMI1640培養(yǎng)基重懸脾細胞，制成均質(zhì)脾細胞懸液。取少量細胞懸液作臺盼藍染色，鑒定活細胞數(shù)(高于98%可用)。將脾細胞懸液調(diào)整到細胞數(shù)2×106ml-1。取脾細胞懸液100 μl加到無菌平底96孔板中，加入OVA至終濃度為100 μg/ml，并設(shè)立陰性對照，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。收集培養(yǎng)上清液。

1.7細胞因子的測定分離大鼠脾臟同時，腹主動脈取血，分離血清。應用ELISA測定大鼠血清和脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ含量。

1.8統(tǒng)計學方法采用SSPS19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、Pearson相關(guān)分析。

2　結(jié)　果

2.1大鼠眼部結(jié)膜炎癥的臨床評估在末次激發(fā)后20 min，裂隙燈顯微鏡觀察，NC組眼部無明顯異常改變，Magone炎癥評分(0.79±0.14)分；AC組明顯有眼部過敏癥狀，包括不同程度

的眼結(jié)膜水腫、充血，眼瞼充血水腫、流淚，炎癥評分(7.64±1.26)分，兩組有明顯差異(P<0.01)。提示AC組出現(xiàn)明顯的急性期變態(tài)反應性炎癥改變。

2.2眼部病理變化NC組眼結(jié)膜無明顯充血水腫，固有層沒有或偶見粒細胞浸潤，穹隆部眼結(jié)膜每高倍鏡下嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)(17.36±6.02)個；AC組結(jié)膜組織疏松，充血水腫明顯，固有層內(nèi)嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤，肥大細胞增加，并有脫顆粒現(xiàn)象，結(jié)膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)(78.27±15.96)個，兩組差異顯著(P<0.05)。見圖1。

2.3大鼠血清、脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ水平與NC組比較，AC組血清、脾細胞培養(yǎng)上清液IL-17、IL-4、IL-6、IL-10水平明顯升高(均P<0.01)，IFN-γ水平明顯降低(P<0.01)。見表1。

圖1　兩組病理切片(Gimesa染色，×400)

組別n血清IL-17IL-4IL-6LL-10IFN-γ培養(yǎng)上清液IL-17IL-4IL-6LL-10IFN-γNC組1020.98±2.1888.76±6.3271.81±6.9482.28±9.4835.02±5.652.59±0.066.12±1.134.91±0.485.66±1.0223.45±3.87AC組2054.64±3.071)128.16±10.641)105.69±9.711)121.44±11.521)11.36±1.981)17.68±2.561)54.62±4.371)54.62±4.371)62.92±5.891)7.96±1.011)

與NC組比較：1)P<0.01，下表同

2.4大鼠血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值A(chǔ)C組血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值較NC組明顯升高(均P<0.01)。見表2。

表2　兩組血清IL-4/IFN-γ、IL-6/IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值比較

2.5AC組血清IL-17與其他指標的相關(guān)性AC組血清IL-17水平與眼部炎癥評分呈明顯正相關(guān)(r=0.914,P<0.01)。AC組血清IL-17水平與眼結(jié)膜嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)呈明顯正相關(guān)(r=0.956,P<0.01)。

3　討　論

AC是眼結(jié)膜對外界致敏原發(fā)生速發(fā)型變態(tài)反應性疾病，T細胞是介導免疫應答的主要細胞。近年研究發(fā)現(xiàn)除輔助性T細胞1(Th1)和輔助性T細胞2(Th2)，在輔助性T細胞中還存在一類新的CD4+T細胞亞群，因其分泌的細胞因子以IL-17為主，因此被命名為Th17〔6〕。IL-17于1993年首次由Rouvier從激活的T細胞雜交瘤中克隆出，其結(jié)構(gòu)獨特，與目前已知的其他IL蛋白結(jié)構(gòu)無相似性。近年來越來越多的研究證實Th17產(chǎn)生的IL-17參與許多變應性疾病，如過敏性哮喘、過敏性鼻炎的免疫炎癥反應病理過程。在小鼠哮喘模型中Th17能上調(diào)Th2介導的嗜酸性粒細胞性氣道炎癥反應〔7〕。IL-17通過活化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶P38促分裂原活化蛋白激酶和核轉(zhuǎn)錄因子-κb等信號激酶調(diào)節(jié)嗜酸性粒細胞功能，放大炎癥反應〔8〕。IL-17介導哮喘氣道中中性粒細胞的浸潤，許多研究證明中性粒細胞浸潤在哮喘發(fā)病中發(fā)揮十分重要作用〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)變應性鼻炎患者鼻腔分泌物中IL-17水平較健康人明顯升高〔10〕。變應性鼻炎患者外周血Th17細胞數(shù)量增加，血清 IL-17水平與患者臨床癥狀的嚴重程度呈正相關(guān)，IL-17參與了過敏性鼻炎的炎癥反應〔11〕。

本研究提示IL-17水平升高參與了大鼠AC發(fā)病的病理生理過程。IL-17作為前炎癥因子能誘導上皮細胞、成纖維細胞釋放IL-6、IL-8、粒-巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞炎癥蛋白-2和生長相關(guān)蛋白-α等炎癥因子和趨化因子，刺激炎癥反應，對T細胞活化起協(xié)同作用〔12〕。IL-17通過誘導IL-8和活化肥大細胞介導中性粒細胞浸潤，促進嗜酸性粒細胞和中性粒細胞參與AC病理過程〔13〕。

Th1和Th2也通過產(chǎn)生不同的細胞因子介導免疫應答。Th1 產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α參與細胞免疫，Th2產(chǎn)生IL-4、IL-6、IL-10參與體液免疫。IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ分別為Th2和Th1細胞產(chǎn)生的特征性細胞因子。這兩組細胞因子的水平分別代表Th2和Th1細胞的功能狀態(tài)〔14〕。本研究結(jié)果表明AC大鼠Th2型細胞因子增多，Th1型細胞因子減少。AC大鼠表現(xiàn)為Th2型優(yōu)勢表達，Th2/Th1比例升高，免疫狀態(tài)由Th1向Th2“克隆漂移”。Th2型細胞因子IL-4、IL-6、IL-10參與了AC發(fā)病的病理生理過程〔15〕。IL-4通過調(diào)節(jié)Ig重鏈基因類型的轉(zhuǎn)換使B細胞由產(chǎn)生IgM轉(zhuǎn)換成產(chǎn)生IgE，IL-4不僅促進B細胞表達分泌IgE還促進嗜酸性粒細胞的趨化〔16〕。IL-6能激活嗜酸性粒細胞，誘導嗜酸性粒細胞的分化和募集。IgE和嗜酸性粒細胞共同介導了大鼠AC的免疫病理過程。小鼠實驗證明，在轉(zhuǎn)化生長因子-β的協(xié)同作用下，IL-6可以誘導Th17分化，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移因子孤獨受體γδ，促進Th17產(chǎn)生IL-17〔17〕。另有實驗證明，應用IL-6中和抗體可阻斷Th17細胞分化，抑制Th17介導的實驗性自身免疫性腦炎的發(fā)生〔18〕。IL-6可促進Th17分泌IL-17。有研究證明，IL-4與IL-17可以共同促進IgE的合成分泌〔19〕。IL-17、Th17與Th2/Th1細胞比值變化相互作用、相互影響共同參與了大鼠AC的免疫學發(fā)病機制。恢復Th2/Th1失衡、抑制Th17免疫應答，減少IL-17產(chǎn)生或拮抗其生物活性可能成為AC治療的一條新途徑。

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〔2015-01-11修回〕

(編輯苑云杰)

黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目(No.2013248);佳木斯大學青年基金項目(No.Sq2014-006)

劉宏偉(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事眼表疾病、白內(nèi)障疾病研究。

張劍(1977-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事眼表疾病、白內(nèi)障疾病研究。

R777.31

A

1005-9202(2016)15-3623-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.006