康體訓練聯合白藜蘆醇干預治療血管性癡呆大鼠模型的療效

牛文亞

(新鄉醫學院體育教學部，河南　新鄉　453003)

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康體訓練聯合白藜蘆醇干預治療血管性癡呆大鼠模型的療效

牛文亞

(新鄉醫學院體育教學部，河南新鄉453003)

目的研究康體訓練聯合白藜蘆醇干預對血管性癡呆(VD)的治療作用。方法50只SD大鼠隨機分為正常對照組、VD模型組、白藜蘆醇組、康體訓練組、康體訓練聯合白藜蘆醇組。通過雙側頸總動脈永久性結扎法制備VD模型，各組大鼠按照分組原則進行處理。8 w后對大鼠進行認知功能檢測,同時對大鼠大腦神經元進行光鏡、電鏡檢測以及鈣離子檢測。結果通過大鼠跳臺試驗、避暗試驗和水迷宮試驗可觀察到康體訓練聯合白藜蘆醇組跳臺、避暗潛伏期明顯延長,通過水迷宮平臺次數增加明顯(P<0.05)。康體訓練聯合白藜蘆醇組大鼠大腦神經元損傷明顯減輕，鈣離子熒光明顯減弱。結論康體訓練聯合白藜蘆醇干預對VD的治療效果優于單獨的藥物治療。

血管性癡呆；康體訓練；白藜蘆醇

血管性癡呆(VD)是由于缺血性或出血性腦血管疾病導致腦損害的一種臨床綜合征，以認知功能異常為突出表現〔1〕。白藜蘆醇(Res)化學名為3，4'，5-三羥基芪，主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖、漿果和花生等植物中〔2〕，具有抗氧化、改善VD患者認知功能等作用〔3～5〕。有文獻報道，康復訓練能增加VD患者長時程記憶效應，改善認知功能〔6〕。如果Res聯合康復治療能夠進一步改善VD患者認知功能，將對VD的治療提供新的思路。本實驗擬探討康體訓練聯合Res干預VD的治療效果。

1　材料與方法

1.1材料雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，4～5月齡，體質量180～220 g，許可證號：SYXK-豫-005-0012，河南省實驗動物中心提供。動物房溫度18℃～20℃，環境潔凈度5 000～8 000級，相對濕度40%～50%，每小時換氣20次，空氣流動速度0.15～0.2 m/s，多級定向控制空氣壓差10%～15%，用自動定時器控制光照期為7：00～19：00、黑暗期為19：00～07：00，飼料為常規大鼠飼料、飲水為二次凈化水。白藜蘆醇(重慶科瑞南海制藥有限責任公司)。主要儀器：電動轉動倉(安徽正華生物儀器設備有限公司)，水迷宮(安徽正華生物儀器設備有限公司)。

1．2方法

1．2．1VD模型制備取雄性清潔級SD大鼠，術前12 h禁食、4 h禁水。采用10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)進行腹腔注射麻醉，但保證術中自主呼吸。將大鼠仰臥位固定于手術臺上，頸部備皮，消毒后頸部正中切口，分離雙側頸總動脈，在頸總動脈的近心端及遠心端分別以雙重“0”號線進行結扎，從中間離斷，確保動脈血流完全阻斷。手術切口給予2 ml慶大霉素后縫合創口，整個手術過程確保無菌操作。術后將大鼠移至通風條件良好的動物房繼續飼養。

1．2．2試驗分組每組10只。①正常對照組：常規飼養24 w。②VD模型組：采用雙側頸總動脈永久性結扎(2VO)制備大鼠VD模型。③Res灌胃組：每天清晨空腹予Res溶液灌胃(灌胃濃度1.35 mg/kg，灌胃容量10 ml/kg)，連續8 w。④ 康體訓練組：每日3次在電動轉動倉(轉速20 r/min，半徑20 cm)里面運動20 min，連續8 w。⑤ 康體訓練聯合Res灌胃組：在電動轉動倉(半徑20 cm，轉速20 r/min)里面運動20 min，3次/d，連續8 w；每天清晨空腹予Res溶液灌胃給藥(灌胃濃度1.35 mg/kg，灌胃容量10 ml/kg)，連續8 w。

1.2.3光鏡觀察用質量分數5%水合氯醛麻醉處死大鼠，采用4%多聚甲醛固定大鼠的腦組織，石蠟包埋切片(切片厚3～4 μm)，HE染色并于光學顯微鏡下觀察。

1.2.4電子顯微鏡樣品制作觀察斷頭處死大鼠，取1 cm3的腦部正方形小塊，4%戊二醛磷酸緩沖液4℃固定，Epon812包埋劑包埋，超薄切片，鉛鈾雙染色，透射電鏡(日立，H-7500)觀察拍片。

1.2.5免疫熒光顯微鏡觀察處死大鼠，制作冰凍切片(厚20 μm)。分別采用Ca2+一抗(1∶800)和熒光標記的二抗(1∶200)進行孵育，熒光顯微鏡下觀察Ca2+在神經元胞質內的表達。

1.3統計學方法采用SPSS20.0軟件，計量資料組間比較采用單因素方差分析，SNK-q法進行多重比較。

2　結　果

2.1大鼠跳臺試驗康體訓練組大鼠與VD模型組相比跳臺實驗的潛伏期明顯延長(P<0.05)；康體訓練聯合Res灌胃組與Res灌胃組比較(P<0.05)?？刁w訓練組大鼠與VD模型組比較平均5 min錯誤次數明顯減少(P<0.05)；康體訓練聯合Res灌胃組與Res灌胃組相比，也有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1　跳臺試驗結果

與VD模型組比較：1)P<0.05；與Res灌胃組比較:2)P<0.05；下表同

2.2大鼠避暗試驗康體訓練組大鼠與VD模型組比較避暗試驗的潛伏期明顯延長(P<0.05)；康體訓練聯合Res灌胃組與Res灌胃組相比較(P<0.05)?？刁w訓練組大鼠與VD模型組比較平均5 min錯誤次數明顯減少(P<0.05)；康體訓練聯合Res灌胃組與Res灌胃組相比較，有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

2.3大鼠水迷宮試驗康體訓練組大鼠與VD模型組比較通過平臺次數明顯增加(P<0.05)；康體訓練聯合Res灌胃組與Res灌胃組相比較，也有顯著性差異(P<0.05)。各組的總游泳距離和平均游泳速度比較無明顯差異。見表3。

表2　避暗試驗結果

表3　水迷宮試驗結果

2.4大鼠海馬區神經元染色Res灌胃組和康體訓練組與模型組相對比，大鼠海馬CA1區的三層錐體細胞呈現規則排列；未發現明顯細胞腫脹，細胞炎癥無明顯浸潤，無增生的星形膠質細胞；錐體細胞形態基本正常，未見變小或胞體呈三角形，頂樹突無明顯延長，核固縮現象及核破裂現象不明顯，胞質呈均勻的嗜伊紅改變；部分錐體細胞核形態無明顯異常，無明顯的胞質疏松和微空泡形成現象；在血管周圍無明顯紅細胞滲出，未見小血管增生現象。表明Res灌胃組及康體訓練組對VD具有明顯的抑制作用并且康體訓練聯合Res灌胃組的抑制作用優于Res灌胃組和康體訓練組。見圖1。

圖1　大鼠海馬區神經元染色結果(HE，×400)

2.5大鼠海馬區神經元電鏡結果Res灌胃組和康體訓練組對比，鏡下見血腦屏障內膜平滑；海馬區神經元細胞體皺縮和膜結構模糊不清現象基本消失。而VD模型組可見細胞質內粗面內質網脫顆粒，內質網、線粒體出現腫脹，部分線粒體嵴融合或空泡樣變性，細胞核固縮，雙層核膜消失，核周呈鋸齒狀，異染色質明顯邊集；Res灌胃組及康體訓練組對VD都具有明顯的抑制作用，神經元形態改變不明顯，細胞內線粒體的腫脹較少，細胞核膜清晰，邊界清楚圓潤，無異染色質邊集現象?？刁w訓練聯合Res灌胃組的抑制作用優于Res灌胃組和康體訓練組，其形態趨于正常對照組。見圖2。

2.6大鼠海馬區鈣離子熒光試驗結果VD模型組大鼠海馬區神經元鈣離子熒光顯色明顯增強，而康體訓練組和Res灌胃組與模型組相比熒光顯色減弱，康體訓練聯合Res灌胃組熒光減弱更加明顯?？梢奟es灌胃組及康體訓練組對VD具有明顯的抑制作用，并且康體訓練聯合Res灌胃組的抑制作用優于Res灌胃組和康體訓練組。見圖3。

圖2　大鼠海馬區神經元電鏡結果(×12 000)

圖3　大鼠海馬區鈣離子熒光試驗結果(×100)

3　討　論

VD是腦血管病的常見并發癥，其發病機制目前認為主要包括自由基損傷，興奮性氨基酸對神經系統的毒性等。因此，使用自由基清除劑和興奮性氨基酸抑制劑可能會延緩腦血管病的發生與發展并有助于防治VD〔7，8〕。Res具有的抗氧化、神經保護作用能對癡呆起到延緩效果，通過對腦神經元細胞器的進一步研究表明，Res具有一定的神經保護作用〔9〕。Res自身為植物雌激素，雌激素對中樞神經系統有促進神經元再生和抽芽及多種血管調節作用。據國外文獻報道，雌激素替代治療可以減輕實驗性腦缺血損傷；流行病學調查結果也顯示，女性絕經期后雌激素水平下降與心腦血管病的發生有緊密的關系，補充雌激素可有效減輕缺血性腦損傷且具有神經保護作用。

本研究提示，與VD模型組相比較，康體訓練聯合用藥組跳臺實驗和避暗實驗的潛伏期明顯延長，大鼠通過平臺次數與VD模型組比較明顯增加，大鼠海馬區神經元損傷明顯減輕，鈣離子熒光明顯減弱。提示康體訓練聯合Res治療能明顯改善慢性缺血后大鼠的認知功能，效果優于單獨的藥物治療。

康復訓練改善VD大鼠認知功能障礙可能與改善雌激素從而減少海馬神經元缺血壞死，減輕腦組織不可逆損害有關〔10～12〕。本研究發現，康體訓練聯合Res治療對VD有明顯的抑制作用,這將為更好地了解VD的發病機制以及通過康體訓練治療VD提供新的靶點。

1Lewis PR,著.高旭光,主譯.MERRT'S 神經病學〔M〕.沈陽:遼寧科學技術出版社,2002:6.

2Fremont L．Biological effects of resveratrol〔J〕．Life Sci，2000;66(8)：663-73．

3Hung LM，Chen JK，Huang SS，etal．Cardioprotective effect of resveratrol，a natural antioxidant derived from grapes〔J〕.Cardiovasc Res，2000;47(3)：549-55．

4Goh SS，Woodman OL，Pepe S，etal．The red wine antioxidant resveratml prevents cardiomyocyte injury following ischemia-reperfusion via multiple sites and mechanisrm〔J〕.Antioxid Redox Signal，2007;9(1)：101-13．

5Ekshyyan VP，Hebert VY，Khandelwal A，etal．Resveratrol inhibits rat aortic vascular smooth muscle cell proliferation via estrogen receptor dependent nitric oxide production〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2007;50(1)：83-93．

6王紅衛,葉青，黃雁，等.康復訓練對血管性癡呆大鼠胰島素抵抗及海馬胰島素降解酶的影響〔J〕.中南大學學報(醫學版),2013;38(11):1167-71.

7Baskys A,Hou AC.Vascular dementia:pharmacological treatment approaches and perspectives〔J〕.Clin Interv Aging，2007;2(3):327-35.

8Korczyn AD.Drugs for vascular dementia〔J〕.Lancet Neurol，2007;6(9):749-51.

9Luo Y，Nie J，Gong QH，etal．Protective effects of icariin against learning and memory deficits induced by aluminium in rats〔J〕.Clin Exp Pharm-acol Physiol，2007;34(8)：792-5．

10Plamondon H，Morin A，Charron C．Chronic 17 beta-estradiol pretreatment and ischemia induced hippocampal degeneration and memory impairments：a 6-month survival study〔J〕.Horm Behav，2006;50：361.

11Joffe H，Hall JE，Gruber S，etal．Estrogen therapy selectively enhances prefrontal cognitive processes：a randomized，double-blind，placebo-controlled study with functional magnetic resonance imaging in perimenopausal and recently postmenopausal women〔J〕.Menopause，2006;13：411．

12段立暉，周國慶，劉錦霞，等．雌激素對去卵巢大鼠學習記憶功能及海馬神經元的保護作用〔J〕.臨床神經病學雜志，2009;22：359．

〔2015-12-24修回〕

(編輯袁左鳴)

國家自然科學基金項目(81200836)；河南省科技廳科技攻關項目(132102310247)；新鄉醫學院重點研究領域招標課題資助項目(ZD2011-30)；新鄉醫學院培育基金(2014QN153、2014YB221)

牛文亞(1981-)，男，碩士，講師，主要從事運動生理學研究。

R749.1

A

1005-9202(2016)15-3612-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.002