響應面法優化野生酸棗仁中總黃酮的提取工藝

蔡雨晴，賈棹東，吳茜茜，白紅進，2，蔣卉，2*

（1.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.南疆化工重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

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響應面法優化野生酸棗仁中總黃酮的提取工藝

蔡雨晴1，賈棹東1，吳茜茜1，白紅進1，2，蔣卉1，2*

（1.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.南疆化工重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

本試驗采用響應面法優化超聲波輔助提取野生酸棗仁中總黃酮的提取工藝。通過單因素試驗考察了乙醇濃度、浸泡時間、超聲溫度和超聲時間對酸棗仁總黃酮提取率的影響，并在此基礎上通過響應面法獲得野生酸棗仁總黃酮的最佳提取工藝。結果表明，野生酸棗仁總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度64.46%、浸泡時間12 h、超聲時間44.02 min、超聲溫度62.86℃，在此工藝條件下酸棗仁總黃酮理論提取率為1.00984%，實際總黃酮提取率為0.9269%。

酸棗仁；總黃酮；超聲波；響應面分析法

酸棗仁是鼠李科（Rhamnaceae）植物酸棗的種子，具有養心補肝、寧心安神、斂汗生津等功效，是較為常用的鎮定安眠的中草藥。酸棗仁中主要化學成分有多糖、黃酮、生物堿、皂苷、三萜、脂肪酸及氨基酸等化合物（張巧月等，2015；林海成等，2015）。李游（2009）研究認為，黃酮類物質為酸棗仁主要有效成分之一。

目前對酸棗仁總黃酮提取工藝的研究較少，且國內學者多采用正交設計和均勻設計來優化提取工藝（張吉祥和歐來良，2012；谷建等，2009）。由于這些方法本身的特點，一般采用線性數學模型擬合試驗結果與影響因素間的關系，而不適合用二次多項式，試驗次數較少，精密度較低，預測性比較差。響應面法是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程分析來尋求最優工藝參數，精密度和預測性較好，可信度較高。本試驗在單因素試驗基礎上，用響應面法優化酸棗仁總黃酮的提取工藝，建立預測模型，旨在為酸棗仁總黃酮提取供理論基礎和技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器野生酸棗仁，于2014年11月采集于陜西省渭南市澄城縣交道鎮阿蘭寨村。

蘆丁標準品（純度＞98%）；石油醚、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純。

DHG-9145A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；LD500搖擺式中草藥粉碎機（長沙市岳麓區常宏制藥機械設備廠）；Sartorius-SQP電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；721-100紫外-可見分光光度計（上海菁華科技有限公司）；RE-50B旋轉蒸發器（上海申生科技有限公司）；儀表恒溫水浴鍋（上海申光儀器儀表有限公）；KQ3200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；800型離心沉淀器（上海手術器械廠）。

1.2試驗方法

1.2.1原料預處理將酸棗仁粉碎，過20目篩，稱取一定量的酸棗仁粉置于索氏提取器中，用10倍體積的石油醚（60～90℃）、60℃水浴回流脫脂2次，每次回流3 h，并回收石油醚。將脫脂后的酸棗仁粉混勻后密封干燥保存。

1.2.2酸棗仁總黃酮含量的測定

1.2.2.1標準曲線的制作蘆丁標準品溶液的制備：精密稱取蘆丁標準品12.00 mg置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解，超聲助溶，定容，得濃度為1.20 mg/mL蘆丁溶液作為標準品母液。

參照刁海鵬等（2004）的方法，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法繪制蘆丁標準曲線，以無水乙醇為空白對照，于波長510 nm測其吸光度。以蘆丁標準液濃度（mg/mL）為橫坐標（X），吸光度（A）為縱坐標（Y）繪制標準曲線。

1.2.2.2樣品中總黃酮提取率的測定供試樣品溶液的制備：精確稱取2.000 g酸棗仁粉，以乙醇濃度為60%，料液比為1∶25，浸泡時間為12 h，在超聲功率為150 W，超聲溫度為60℃的條件下超聲提取40 min，提取液以3000 r/min離心20 min，即得供試樣品溶液。

取5 mL供試樣品溶液于50 mL容量瓶中，按測定蘆丁標準溶液吸光度的方法測定樣品溶液吸光度，計算總黃酮提取率。計算公式（李游，2009）為：

式中：C為總黃酮提取液的質量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；D為溶液稀釋倍數；M為酸棗仁的質量，g。

1.2.3超聲波輔助提取總黃酮單因素試驗設計精確稱取酸棗仁粉2.000 g，選擇乙醇濃度0%、20%、40%、60%、80%、100%，料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，浸泡時間4、8、12、16、20、24 h，超聲時間10、20、30、40、50、60 min，超聲溫度30、40、50、60、70、80℃進行單因素試驗，考察各個因素對酸棗仁總黃酮提取率的影響。

1.2.4響應面法優化酸棗仁總黃酮提取工藝在單因素試驗結果基礎上，運用Design-Expert軟件，根據Box-Benhnken中心組合設計四因素三水平試驗，以乙醇濃度、浸泡時間、超聲溫度、超聲時間為自變量，酸棗仁總黃酮提取率為響應值設計響應面試驗，因素和水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗因素與水平

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線的繪制標準曲線如圖1所示。在0.06～3.0 mg/mL濃度時，吸光度（A）與標準品濃度（mg/mL）線性關系良好。

圖1　蘆丁標準曲線

2.2單因素試驗結果分析

2.2.1乙醇濃度對酸棗仁總黃酮提取率的影響在料液比為1∶20，浸泡時間為8 h，超聲功率150 W，超聲時間為40 min，超聲溫度為40℃的條件下，選取0%、20%、40%、60%、80%、100%乙醇考察乙醇濃度對總黃酮提取率的影響，每個水平重復3次，不同乙醇濃度對酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2　乙醇濃度對酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當乙醇濃度達到60%時，提取率達到峰值，然后隨著乙醇濃度的增大，提取率逐漸下降，可能是由于乙醇濃度的增大影響了黃酮類化合物的溶解度，導致提取率下降，因此確定最佳乙醇濃度為60%。

2.2.2料液比對酸棗仁總黃酮提取率的影響在乙醇濃度為60%，浸泡時間為8 h，超聲功率為150 W，超聲時間為40 min，超聲溫度為40℃的條件下，分別選取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，考察料液比對總黃酮提取率的影響，每個水平重復3次，不同料液比對酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3　料液比對酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當料液比達到1∶25時，提取率達到峰值，然后隨著料液比的增大提取率逐漸下降，因此確定最佳料液比為1∶25。

2.2.3浸泡時間對酸棗仁總黃酮提取率的影響在乙醇濃度為60%，料液比為1∶25，超聲功率為150 W，超聲時間為40 min，超聲溫度為40℃的條件下，浸泡時間分別選取4、8、12、16、20、24 h，考察不同浸泡時間對總黃酮提取率的影響，每個水平重復3次，不同浸泡時間對酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖4所示。

圖4　浸泡時間對酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著浸泡時間的增加，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當浸泡時間達到12 h時，提取率達到峰值，然后隨著浸泡時間的增大提取率逐漸下降，可能是因為長時間浸泡使黃酮類化合物氧化破壞，因此確定12 h為最佳浸泡時間。

2.2.4超聲時間對酸棗仁總黃酮提取率的影響在乙醇濃度為60%，料液比為1∶25，浸泡時間為12 h，超聲功率為150 W，超聲溫度為40℃的條件下，選取超聲時間分別為10、20、30、40、50、60 min，考察超聲時間對總黃酮提取率的影響，每個水平重復3次，不同超聲時間對酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖5所示。

圖5　超聲時間對酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖5可知，隨著超聲時間的延長，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當超聲時間達到40 min時，提取率達到峰值，然后隨著超聲時間的增大提取率逐漸下降，可能是由于超聲時間過長破壞了黃酮類化合物的結構，導致提取率下降，因此確定最佳超聲時間為40 min.

2.2.5超聲溫度對酸棗仁總黃酮提取率的影響在乙醇濃度為60%，料液比為1∶25，浸泡時間為12 h，超聲功率150 W，超聲時間為40 min的條件下，選取30、40、50、60、70、80℃不同超聲溫度，考察溫度對總黃酮提取率的影響，每個水平重復3次，不同超聲溫度對酸棗仁總黃酮提取率的影響見圖6所示。

圖6　超聲溫度對酸棗仁總黃酮提取率的影響

由圖6可知，隨著超聲溫度的增加，酸棗仁總黃酮提取率逐漸增加，當超聲溫度達到60℃時，提取率達到峰值，然后隨著超聲溫度的增大提取率呈下降趨勢，可能是溫度影響了黃酮化合物的穩定性，因此確定60℃為最佳超聲溫度。

2.3響應面試驗結果與分析綜合單因素試驗結果，固定料液比為1∶25，超聲功率為150 W，選擇4個重要的因素乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度、浸泡時間為自變量進行響應面優化試驗，試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2　響應面試驗設計及結果

表3　響應面回歸模型方差分析

采用Design Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行多元回歸擬合，得到乙醇濃度（A）、浸泡時間（B）、超聲時間（C）和超聲溫度（D）四因素三水平的二次多項回歸模型方程為：

模型的可靠性可通過方差分析及相關系數來考察，模型相關系數R2=0.9611，說明該模型擬合較好，試驗數值與預測值比較接近。由表3可知，模型F值為24.7226，P＜0.0001，說明該回歸模型達到了極顯著水平。失擬項P=0.5355＞0.05，說明失擬不顯著，因而可以用該模型對酸棗仁總黃酮提取進行分析和預測。由回歸模型和方差分析可知，方程交互項AB，二次項A2、D2對酸棗仁總黃酮提取率的影響達到極顯著水平。根據F值可知，各因素對酸棗仁總黃酮提取率的影響大小順序為：乙醇濃度（A）＞浸泡時間（D）＞超聲時間（B）＞超聲溫度（C）。

圖7～12為根據擬合模型繪制的酸棗仁總黃酮提取率的三維響應面和等高線圖，等高線圖可直觀地反映各因素對酸棗仁總黃酮提取率的交互作用程度。由等高線可以直觀的反映出各因素與對酸棗仁黃酮提取的影響。等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著。由圖7、10、11可以看出兩因素的等高線呈馬鞍形，表明乙醇濃度（A）與浸泡時間（D）、超聲時間（B）與浸泡時間（D）、超聲溫度（C）與浸泡時間（D）兩兩交互作用顯著。由響應面圖可以看出乙醇濃度（A）對酸棗仁總黃酮提取率的影響最大，因為曲線最為陡峭。

利用Design-expertV 8.0.6統計軟件對回歸模型進行優化處理，得到超聲波輔助提取酸棗仁總黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度64.46%，浸泡時間12 h，超聲溫度62.86℃，超聲時間44.02 min，在此工藝條件下酸棗仁總黃酮理論提取率為1.00984%，實際總黃酮提取率為0.9269%。

圖7　乙醇濃度、浸泡時間相互作用對總黃酮提取率影響響應面趨勢圖（a）和等高線（b）

圖8　乙醇濃度、超聲時間相互作用對總黃酮提取率影響響應面趨勢圖（a）和等高線（b）

圖9　乙醇濃度、超聲溫度相互作用對總黃酮提取率影響響應面趨勢圖（a）和等高線（b）

圖10　浸泡時間、超聲時間相互作用對總黃酮提取率影響響應面趨勢圖（a）和等高線（b）

3　結論

本試驗以脫脂后的酸棗仁為材料，采用超聲波輔助提取其總黃酮，根據單因素試驗結果，用Box-Benhnken設計響應面試驗，建立了乙醇濃度、浸泡時間、超聲溫度和超聲時間對酸棗仁總黃酮提取率的回歸模型，并對模型進行失擬，經過試驗驗證了該方法具有可信度，能夠較好地預測酸棗仁總黃酮的提取率。得到超聲波輔助提取酸棗仁總黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度64.46%，浸泡時間12 h，超聲溫度62.86℃，超聲時間44.02 min，在此工藝條件下酸棗仁總黃酮提取率為1.00984%，實際操作得到酸棗仁總黃酮提取率為0.9269%。

圖11　浸泡時間、超聲溫度相互作用對總黃酮提取率影響響應面趨勢圖（a）和等高線（b）

圖12　超聲時間、超聲溫度相互作用對總黃酮提取率影響響應面趨勢圖（a）和等高線（b）

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The response surface methodology was used to optimize the extraction process of flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen.The effects of ethanol concentration，soaking time，ultrasonic temperature，ultrasonic time and material to liquid ratio on extraction rate of flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen were examined，and on the basis，the optimum extraction technology was obtained via response surface methodology.The results showed that the best extraction conditions for flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen were as follows:ethanol concentration was 64.46%，soaking time was 12 h，ultrasonic time was 44.02 min，ultrasonic temperature was 62.86℃，the theoretic extraction rate for flavonoids in wild Ziziphi spinosae semen was 1.00984%，and the actual extraction rate was 0.9269%.

Zizyphi spinosi semen；total flavonoids；ultrasonic；response surface methodology

中國·豬營養國際論壇

S816.7

A

1004-3314（2016）03-0023-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160306

浙江大學馥莉食品研究院基金資助項目（KY201404）；國家大學生創新創業訓練計劃項目（201410757011）