日糧中不同稻殼替代水平對19～28日齡仔鵝腸道微生物區系的影響

蔡中梅，王志躍，楊海明

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009）

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科學實驗研究

日糧中不同稻殼替代水平對19～28日齡仔鵝腸道微生物區系的影響

蔡中梅，王志躍*，楊海明

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009）

本試驗旨在利用PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳）技術研究日糧中不同稻殼替代水平對19～28日齡揚州鵝腸道微生物區系的影響。選用19日齡揚州公鵝260只，隨機分成4組，每組5個重復，每個重復13只。A組飼喂基礎日糧，B、C、D組分別飼喂7%、14%、21%稻殼替代的基礎日糧。在28日齡時采集各腸段內容物進行總DNA的提取，對細菌16S rRNA V3區用細菌通用引物進行PCR擴增，利用DGGE電泳技術分析腸道微生物區系。結果顯示：不同稻殼替代水平對十二指腸、空腸、盲腸菌群條帶總數量影響不明顯，但共有條帶存在一定差異；十二指腸、空腸各組間菌群相似性程度均較低，盲腸組間相似性程度最高。由此可見，不同程度的稻殼替代能夠影響腸道菌群分布，其中對十二指腸、空腸影響較大，對盲腸影響較小。

揚州鵝；稻殼替代水平；變性梯度凝膠電泳；微生物；腸道

鵝是草食性動物，在其空腸后段、回腸、盲腸內存在大量微生物，所以鵝在利用粗纖維方面具有較大優勢。Hamer（2008）認為，纖維物質能為腸道微生物菌群提供能量。此外，微生物菌群對纖維類物質進行代謝可產生營養物質，如短鏈脂肪酸、維生素、氨基酸等。戰利（2012）研究指出，高水平纖維日糧能顯著影響鵝腸道微生物菌群多樣性。劉蓓一（2012）研究發現，不同纖維水平對鵝盲腸菌群的調控起主要作用，盲腸微生物種類會隨著纖維水平的提高而增加，且盲腸中以不可培養的細菌為主。

以前微生物研究大多采用傳統的分離培養方法，重復性差，且絕大多數腸道菌群需要厭氧環境，而目前厭氧培養技術還不是很完善。隨著16S rRNA為基礎的分子生物技術的不斷發展，許多可鑒定不可培養微生物新技術相繼出現。變性梯度凝膠電泳（DGGE）因其準確、重復性好等優點，在動物胃腸道菌群研究方面得到了廣泛的應用。本試驗擬用PCR-DGGE技術研究不同稻殼替代水平日糧對揚州鵝各腸段微生物區系的影響，為進一步探討鵝消化纖維機制積累理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗設計試驗選用260只健康、體重基本一致的19日齡揚州鵝公鵝，隨機分為4組，每組5個重復，每個重復13只。其中A組飼喂基礎日糧，B、C、D組分別飼喂7%、14%、21%稻殼替代日糧。

1.2日糧組成與飼養管理基礎日糧參照美國NRC標準（1994）、前蘇聯畜牧科學研究所（1985）的建議及本教研室歷年研究成果進行配制（張宏福，1995），基礎日糧組成及營養水平見表1。試驗鵝采取網上平養，自由采食飲水，常規免疫程序免疫。

表1　基礎日糧組成及營養水平（風干基礎）

1.3樣品采集于28日齡宰殺試驗鵝，每組取5只，無菌操作，取各腸段內容物，將同組5只鵝的各腸段內容物均勻混合，并快速置于-70℃保存備測。

1.4試驗方法

1.4.1腸道菌群總DNA的提取按照TIANamp Stool DNA Kit（TIANGEN）試劑盒的使用說明來提取鵝各腸段微生物總DNA。提取好的DNA置于-20℃冰箱保存備用。

1.4.2總DNA的定量及純度檢測DNA的含量用Spectrophotometer DNA定量儀（Thermo公司）進行測定，采用OD260/OD280方法檢測DNA的純度。用0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA片段的大小。

1.4.3總DNA的PCR擴增利用大腸桿菌16S rRNA V3區的片段基因設計合成通用引物。F338-GC為5’端加40個堿基的“GC”發夾：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'與R518：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反應體系及反應條件按照2×Tap PCR MasterMix（TIANGEN）試劑盒使用說明進行操作。最后用1.0%瓊脂糖電泳對PCR產物進行檢測。

1.4.4變性梯度凝膠電泳用8%的聚丙烯酰胺凝膠對上述擴增產物進行電泳分離。變性劑濃度為45%～60%。在1×TAE緩沖液、80 V、60℃條件下電泳12 h。電泳結束后用硝酸銀溶液染色，顯影后在Vilber凝膠成像掃描系統上進行成像。

1.5數據分析使用Quantity One分析軟件包（Bio-rad公司）對各條帶進行分析。通過相似性指數（Cs）來比較不同稻殼替代水平日糧對鵝各腸段微生物多樣性的影響，計算公式如下：

式中：Nx為x泳道的條帶數；Ny為y泳道的條帶數；j為2個泳道共有的條帶數。

2　結果與分析

2.1腸道微生物總DNA及PCR產物大小試驗結果表明，除回腸之外，各腸段DNA純度較高，DNA片段大小在23 kb左右。由圖1可見，總DNA經16S rRNA V3區引物擴增后可得到約200 bp的擴增產物，效果較好，可用于后續的DGGE分析。

圖1　各腸段菌群16S rRNA V3區PCR擴增

2.2不同稻殼替代水平對腸道微生物區系的影響各試驗組樣本經DGGE分離出數目不一樣的電泳條帶，且條帶在遷移率及強度上存在一定的差異（圖2）。十二指腸、空腸、回腸、盲腸的平均條帶數為16.25、16、9.25、30.5條，說明鵝盲腸菌群最豐富，其次是十二指腸和空腸，回腸菌種最少，尤其是D組回腸微生物條帶僅為4條。

由圖2可知，十二指腸各處理組間條帶數量相近，但共有性條帶較少，差異條帶較多。如1是A、B、D組共有條帶，C組和D組之間存在差異條帶2、3，差異不明顯，A組和B組之間存在差異條帶4、5、6，A組和C組雖然條帶數相同，但差異條帶較多。相比于十二指腸，空腸各組間共有條帶相對較多，且21%稻殼替代組微生物條帶數最多。回腸微生物數量最少，其中D組只有4個條帶，除了A組和B組含有較多共同條帶，其他各組間菌群組成差異較大，只有1種相同微生物甚至沒有，如A組和D組。盲腸各處理組間條帶遷移位置相近，不同處理組間大部分為共性條帶，但也有差異性條帶。如圖中a、b是前三組的共有菌，不存在于D組中，而c代表的微生物存在于B、C、D組，在A組中不存在。A組和B組之間存在差異條帶e、f和g等。

圖2　各腸段微生物DGGE電泳條帶示意圖

除此之外，各處理組間部分條帶的粗細有所不同。條帶的粗細不同表明微生物DNA濃度有差異。條帶越粗，代表該種微生物含量越高，反之則越少。

2.3不同處理組間菌群相似性分析Cs值越大，表明兩組樣品的相似性程度越高。由表2可知，十二指腸各組間相似性程度都較低，其中A組和C組相似性指數最低，僅為28.6%，說明兩組間差異條帶較多。空腸各組間相似性指數較小，但與十二指腸相比，其組間相似性程度稍高。回腸各組間除A組和B組相似程度較高之外，其他各組間幾乎沒有相似性。盲腸各組相似性程度最高。其中B組和C組之間相似性指數最大，為87.1%。A組和D組之間相似性程度最低，為73.3%，說明兩組之間差異條帶相對較多。隨著稻殼替代比例的增加，D組與其他3組條帶相似性程度都相對較低。

表2　各腸段4組間主要菌群的相似性分析指數

3　討論

即使在相同日齡、環境、日糧營養水平等條件下，宿主微生物菌群也會表現出不同的DGGE指紋圖譜，說明個體對腸道菌群組成影響很大。不同個體腸道菌群分布、種類及數量均有差異。van der Wielen等（2002）研究指出，同一日齡肉雞即使飼養在相同環境中并且飼喂同種飼料，結果微生物菌群卻呈現出不同的帶譜，表明個體因素對腸道細菌群落組成具有重要影響作用。陳波等（2012）研究表明，影響腸道微生物多樣性的因素有很多，其中腸道菌群結構因個體差異而極為不同。Cong等（2007）對2～15只雞分別混合后的樣品圖譜進行觀察與分析，結果發現5個以上的個體樣品混合才能代表整體菌群組成。所以為了盡可能避免個體因素而引起的差異，本試驗每組采集5只鵝各腸段內容物均勻混合以便提取的總DNA更具有代表性。

微生物菌群數量的多少依賴于日糧成分和營養濃度的變化。Awati（2005）研究指出，日糧組成影響健康動物腸道菌群中的優勢菌種，其中日糧纖維影響較大。鵝與其他家禽不同，其盲腸中存在大量微生物，能夠消化利用適量的粗飼料。日糧纖維可作為碳水化合物被體內微生物發酵，部分分解成揮發性脂肪酸被動物吸收利用。黨國華和王恬（2005）研究指出，鵝消化粗纖維所獲得的能量中6%～18%來自于纖維素，2%～4%來自于半纖維素。本試驗結果表明，隨著稻殼替代比例增加，盲腸微生物多樣性最豐富，且條帶也呈增加趨勢。這與劉蓓一（2012）、張名愛等（2007）研究結果一致，他們認為不同纖維水平的日糧主要對鵝盲腸菌群多樣性起主要作用，盲腸中微生物種類隨纖維水平的提高而增加。胡敏華和胡民強（2010）研究指出，日糧中粗纖維水平在5.03%～8.98%，肉鵝腸道內乳酸桿菌的數量隨著纖維水平的上升而顯著增加，其可能的原因是家禽內源性消化酶不能降解非淀粉多糖，致使其中的養分流入后段腸道，從而引起細菌的增殖。

圖譜中條帶的數量及位置反映了微生物菌群的多樣性。本試驗中，28日齡雛鵝十二指腸、空腸、回腸、盲腸的平均條帶數分別為16.25、16、9.25、30.5。其中回腸微生物含量最少，盲腸微生物多樣性最豐富，盲腸段A組和B組雖然條帶數相同，但相似性指數僅為79.3%，說明對日糧進行7%稻殼替代會使兩組差異條帶數增加。D組與其他各組相似性程度相對較低，原因可能是隨著稻殼替代比例的增加，D組菌群結構發生改變，且部分條帶的種類和數量可能也會相應發生變化。可見，日糧中纖維水平的增加，會促使盲腸段部分微生物菌種的出現或數量的增加。至于菌種及其數量還需進一步的克隆測序及細菌定量測定來完成。

4　結論

4.1隨著稻殼替代比例的增加，十二指腸、空腸菌群條帶數相對較穩定，盲腸微生物條帶數呈現增加趨勢，但差異不大。

4.2十二指腸、空腸各組間菌群組成差異較大，盲腸各組間菌群組成相似性程度較高。

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This experiment was conducted to study the effects of different proportions of rice husk replaced diets on intestinal microflora of geese from 19～28 days by denaturing gradient gel electrophoresis.Two hundred and sixty 19-dayold healthy Yangzhou geese were randomly assigned into 4 groups with 5 replicates of 13 geese each.The control group（A）were fed with basic diet（A）；groups B，C，D were fed with 7%，14%，21%rice husk replaced diets，respectively.The genomic DNA was extracted from the content of various intestinal segments at the age of 28 days.The V3 variable region of bacterial 16S rRNA was amplified with universal primer.Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of the amplicons were analyzed.The results showed that different proportions of rice husk replaced diets had no significant effects on the band quantity of microflora in duodenum jejunun，and cecum of geese，the common bands were different.And different proportions of rice husk replaced diets had no significant effects on the microflora similarity degree in duodenum and jejunum，the similarity index in cecum was maximal.Therefore，different proportions of rice husk replaced diets mostly affected intestinal microflora of duodenum and jejunum and rarely affect the cecum.

Yangzhou geese；rice husk replaced level；denaturing gradient gel electrophoresis；microflora；intestine

S815

A

1004-3314（2016）03-0009-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160302

國家現代農業產業技術體系（CARS-43-27）；揚州大學“新世紀人才工程”資助