小鼠尾懸吊法模擬微重力對骨代謝的影響

李　煜，張新昌，朱　雷，李　軍，孫明林

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小鼠尾懸吊法模擬微重力對骨代謝的影響

李煜1，張新昌2，朱雷1，李軍1，孫明林1

目的研究模擬微重力條件對小鼠骨代謝的影響。方法8周齡野生型C57小鼠，分別尾懸吊0周(對照組)、2周、4周，檢測小鼠血清生化指標(Ca2+、ALP、BGP)；分離股骨行Micro-CT掃描，檢測股骨微觀結構的改變；三點彎曲試驗檢測股骨的力學性能。所得數據用SPSS18.0進行統計學分析。結果與對照組相比，尾懸吊2、4周組小鼠血清Ca2+濃度依次升高，而血清ALP、BGP濃度逐漸降低：血清Ca2+在懸吊0、2、4周值為(2.134±0.081)mmol/L，(2.261±0.079)mmol/L，(2.388±0.061)mmol/L，與對照組相比具有統計學意義(P<0.05)；血清ALP濃度為(4.598±0.478)U/100 ml，(3.447±0.393)U/100 ml，(3.142±0.328)U/100 ml，差異具有統計學意義；血清BGP濃度(8.529±0.523)ng/ml、(8.108±0.392)ng/ml、(7.832±0.282)ng/ml。股骨Micro-CT掃描結果顯示：懸吊組小鼠股骨骨小梁數量減少，間隙增大，厚度降低，其中以骨體積比下降最為明顯，懸吊2、4周值為對照組的47.3%、14.3%。三點彎曲結果顯示尾懸吊后股骨極限強度及彈性模量均降低，對力耐受減弱，對照組、懸吊2、4周股骨骨折斷裂能量為(6.220±0.482)mJ；(4.395±0.301)mJ；(2.855±0.425)mJ,與對照組相比具有統計學意義(P<0.05)。結論尾懸吊法能造成小鼠骨鈣流失和骨質疏松，且嚴重程度與懸吊時間成正相關。

微重力；尾懸吊；骨質疏松；小鼠

失重條件對骨的破壞比其對其他組織破壞更明顯，更嚴重。它導致短時間內大量骨鈣流失，造成嚴重的骨質疏松，使骨的脆性增加，骨折的風險增高；同時短時間內較多的Ca2+進入血液系統，又會對機體造成其他不良后果[1]。因此，進一步研究微重力條件對骨組織本身及骨代謝的影響就顯得尤為重要。本實驗采用C57小鼠尾懸吊法模擬微重力條件，分別懸吊2、4周，檢測不同微重力時間下小鼠骨結構及力學性能的改變，為應對失重對骨質疏松及其他不良反應提供資料。

1　材料與方法

1.1實驗材料與儀器野生型C57小鼠(由軍事醫學科學院動物研究所提供)、戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑公司)、鈣測定試劑盒(南京城建)、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(南京城建)、BGP ELISA 檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)、蘇木精伊紅染色試劑盒(HE染色試劑盒，武漢博士德生物公司)。主要儀器：電子天平(美國Denver)、低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)、紫外可見分光光度儀(美國BD公司)、酶標儀(瑞士TECAN公司)、INSTRON 5865材料試驗機(美國INSTRON公司)、Skyscan 1076 Micro-CT掃描儀(比利時Skyscan公司)、冰凍切片機(德國LEICA公司)。

1.2分組及尾懸吊模型8周齡C57小鼠18只，雌雄不限，隨機分成3組，并記錄體重。保持鼠籠潔凈，保證充足的食物及清水供應及足夠的光照，環境溫度維持在(23±3)℃。懸吊組小鼠尾巴用醫用膠布固定，細線一段懸吊尾巴，另一端固定在飼養籠上。使小鼠后肢不能接觸地面，前肢著地。小鼠頭軀干與水平面膜呈30°，能夠自由飲水及取食。分別培養2、4周，懸吊結束再次稱量小鼠體重，體重下降15%記為懸吊失敗。對照組小鼠在鼠籠中不行尾懸吊飼養。

1.3小鼠血清生化指標各組小鼠懸吊結束后，斷頭取血，離心獲取血清并做好標記，-20 ℃保存。取適量血清分別與相應的檢測試劑反應，在分光光度計或酶標儀對應波長下得出吸光度(OD值)，并由此計算出Ca2+、ALP及BGP濃度。

1.4方法小鼠Micro-CT 股骨掃描小鼠處死后，立即剝離股骨至EP管中，每管加入少量PBS，保持骨組織濕潤，做好標記，-80 ℃保存，用Skyscan 1076 Micro-CT(由北京航空航天大學提供)掃描股骨，分辨率設置為9 μm，進行3維重建，最后得出骨體積比(BV/TV)，骨小梁模式因子(Tb. Pf)，骨小梁厚度(Tb. Th)，骨小梁數量(Tb. N)，和骨小梁分離度(Tb. Sp)等股骨三維相關參數，評估各組小鼠股骨微觀結構的變化。

股骨三點彎曲試驗取分離好的骨組織，用INSTRON 5865試驗機對其進行三點彎曲試驗，跨距設為1 cm，加載速度2 mm/min，勻速加載，記錄載荷-變形曲線，得到各組股骨力學相關參數：斷裂位移、斷裂應變、斷裂載荷和斷裂能量，做統計學分析，并評估骨的力學性能。

2　結　　果

2.1一般情況小鼠尾懸吊各組小鼠生長良好，無一死亡，懸吊2周、4周組各有1只小鼠體重下降超過15%，不計入實驗對象，其余小鼠符合試驗要求。

2.2血清生化指標檢測與對照組相比，懸吊2、4周小鼠血清Ca2+均出現升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，懸吊4周血清Ca2+升高幅度更大；懸吊2、4周血清ALP濃度均下降，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)，懸吊4周血清ALP濃度下降更明顯；懸吊2周小鼠血清BGP濃度未見明顯下降，差異無統計學意義，懸吊4周BGP濃度出現明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1　小鼠血清生化指標檢測值　±s)

注：與對照組比較，①P<0.05；②P<0.01

2.3Micro-CT掃描股骨CT掃描成像結果尾懸吊小鼠均表現出不同程度骨質疏松，骨小梁數量減少，間距增寬(圖1)；股骨三維重建數據同樣顯示尾懸吊小鼠骨小梁數目降低，厚度減少，分離度增寬，骨小梁模式因子增大，表現出骨質疏松癥狀，且懸吊4周小鼠表現出更明顯的骨質疏松癥狀(表2)。

圖1　Micro-CT掃描各組小鼠股骨圖

指標對照組(n=6)懸吊2周(n=5)懸吊4周(n=5)BV/TV(%)9.149±0.3124.319±0.292②1.304±0.199②Tb.Pf(1/mm)24.320±1.15631.120±1.745②37.610±1.964①Tb.Th(μm)67.730±3.65058.280±2.470①50.230±2.050①Tb.N(1/mm)1.599±0.0390.950±0.035①0.444±0.018②Tb.Sp(mm)0.248±0.0130.391±0.012①0.568±0.015②

注：Micro-CT檢測股骨相關參數：BV/TV(骨體積比)，Tb. Pf(骨小梁模式因子)，Tb. Th(骨小梁厚度)，Tb. N(骨小梁數量)，Tb. Sp(骨小梁分離度)。與對照組比較，①P<0.05，②P<0.01

2.4小鼠股骨三點彎曲試驗由于尾懸吊小鼠出現較為明顯的骨質疏松情況，導致小鼠股骨力學性能的下降，使骨的彈性模量及對力的耐受降低，股骨三點彎曲試驗能夠較好的檢測股骨的力學性能。對各組小鼠股骨行三點彎曲試驗結果顯示，和對照組相比，懸吊2周小鼠股骨斷裂位移、斷裂應變、斷裂載荷、斷裂能量均顯著下降(P<0.05)，懸吊4周后骨的上述參數下降更明顯(P<0.01，表3)。

表3　小鼠股骨三點彎曲力學實驗結果　±s)

注：與對照組比較，①P<0.05，②P<0.01

3　討　　論

人體的骨骼起著支撐、運動和保護機體的重要作用，是機體的重要組成部分。骨質疏松的形成有其復雜的成因，如糖尿病患者中骨質疏松的發病率遠高于健康人群[2]，骨質疏松的危險因素還有吸煙、飲酒、糖皮質激素的濫用等[3]。一定的外界力學載荷刺激能促進骨的形成及礦化，能較有效的延緩骨質疏松出現。因此，在地球上，重力作用對維持骨的健康起著重要作用，而太空中飛行員由于失去重力后不可避免的會出現失重性骨質疏松；久臥在床，行動不便的病人同樣會出現廢用性骨質疏松，使骨強度降低，抗外力作用減弱，極易發生骨折，給機體的健康及生活帶來嚴重影響[4]。尾懸吊法能較好的模擬失重環境對骨組織本身及骨代謝引起的其他問題，該法最早由MOREY-HOLTON 和 WRONSKI建立，經過不斷改進現在已成為較成熟的研究失重條件對機體影響的方法之一。史曉等[5]通過檢測尾懸吊大鼠腰椎骨密度變化，發現尾懸吊法能很好地制造出骨質疏松模型。但尾懸吊法使得小鼠頭部較低，尾部較高，對小鼠有一定的影響，尤其在懸吊前3 d會出現進食減少，活動降低，身體消瘦，情緒低落等[6]。為此，在該試驗中小鼠體重下降超過15%，即為懸吊失敗，以排除進食減少、小鼠適應性差等混雜因素的干擾[7]。

Guo等[8]發現，尾懸吊28 d大鼠股骨骨小梁減少，排列稀疏，同時他還發現懸吊組4周大鼠股骨中成骨細胞數量較對照組明顯下降。Dave等[9]發現，尾懸吊2周大鼠出現皮質骨和松質骨明顯減少,骨小梁厚度及數量也均減少，網狀結構連接稀疏，骨形成率顯著降低。在本研究中，尾懸吊2周后小鼠骨小梁即出現一定程度的下降，而懸吊4周骨小梁出現明顯下降，骨小梁稀疏，網狀結構減少，與皮質骨節點減少，游離骨小梁增多。均表明尾懸吊小鼠出現明顯骨質疏松癥狀。

BGP是骨中含量豐富的非膠原蛋白，能促進骨的形成，它的合成受1,25-(OH)2D3調節[10]。付重建等[11]通過懸吊大鼠股骨原位雜交及三色染色法示懸吊2、4周大鼠骨組織髓中BGP表達量均出現下降，懸吊2周股骨BGP含量高于懸吊4周。同時隨著懸吊時間延長，股骨脫鈣現象更明顯。本研究結果發現，尾懸吊小鼠出現血清BGP濃度降低，與骨中BGP變化趨勢相一致。同時，血清中增高的Ca2+與骨質破壞程度，骨中鈣丟失量密切相關。即骨質疏松越嚴重，血清Ca2+濃度升高越明顯[12]。

失重性骨質疏松患者由于骨質的破壞導致骨脆性增加，在較小應力下即可出現股骨粗隆和腰椎骨折，表明其骨的強度下降。在尾懸吊小鼠三點彎曲試驗中，小鼠斷裂負荷、斷裂位移均降低，精確表明骨質抗外力作用減弱。李昊等[13]發現，適當的外力刺激對小鼠骨質疏松具有較好的治療作用。同時發現，在適當的刺激一段時間后之后，小鼠骨質疏松狀況明顯緩解，同時血清Ca2+和BGP濃度也隨之下降，二者之間有較好的相關性。由于骨質疏松患者常常出現骨折癥狀才進行針對性治療，給患者帶來較大的痛苦及經濟壓力[14]，能否根據血清Ca2+、BGP濃度判斷患者骨質疏松嚴重程度，進行有效預防，尚需進一步研究。

綜上所述，尾懸吊法能造成小鼠骨鈣流失和骨質疏松，且嚴重程度且與懸吊時間成正相關。下一步，將對血清Ca2+、BGP濃度與骨質疏松程度是否存在一定關系進行研究。

[1]Saxena R, Pan G, McDonald J M. Osteoblast and osteoclast differentiation in modeled microgravity [J]. Ann N Y Acad Sci, 2007,1116:494-498.

[2]董松,崔立芹,雷蕾,等.2型糖尿病并發骨質疏松的相關危險因素[J]. 武警醫學，2015，26(8):824-827.

[3]宮麗娜,牛志燕,蘇巍.糖皮質激素性骨質疏松伴多發脆性骨折[J]. 武警醫學，2015，26(7):753-754.

[4]Ohshima H, Mukai C. Bone metabolism in human space flight and bed rest study[J]. Clin Calcium, 2008,18(9): 1245-1253.

[5]史曉,王翔,杜修東,等. 大鼠尾懸吊骨質疏松模型初探[J].中國現代醫學雜志2009,19(2): 341-343.

[6]章曉東,余震,劉納新.大鼠體力及精神狀態評價的行為學新技術[J].溫州醫學院學報，2009,13(2):137-140.

[7]宋敏,李晶.大鼠骨質疏松模型的復制方法及意義[J].當代醫學,2012,8(6):16-18.

[8]Guo R, Hh M, Sun Z Y,etal. Effects of simulated weightlessness on rats mandible, lumbar vertebra and femur [J]. SpaceM Med Eng, 2005, 18(3):165-169.

[9]Dave V, Lafage P H, Laroche N,etal. Two-week longitud in al survey of bone arch-itecture alteration in the hind limb-unloaded rat model of bone loss:sex differences[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2014,9(3):440-447.

[10]Tsuji H, Cawthorn C, Ecarot B. Abnormal modulation of serum osteocalcin by dietary phosphate and 1,25-dihydroxyvitamin D3 in the hypophosphatemic mouse [J].Bone Miner Res,2013, 11(9): 1234-1240.

[11]付重建,郁冰冰,楊連甲,等.尾懸吊大鼠骨和骨髓中骨鈣素的變化[J].航天醫學與醫學工程,2005,16(4):260-263.

[12]Wu D D, Boyd R D, Fix T J,etal. Regional patterns of bone loss and altered bone remodeling in response to calcium deprivation in laboratory rabbits [J]. Calcif Tissue Int, 1990, 47(1): 18-23.

[13]李昊, 李瑞欣, 張西正, 等. 周期性動態力學載荷對抗骨質疏松的研究[C].北京：軍事醫學科學院出版社,2013：31-42.

[14]Zhu W, Yang M L, Yang GY,etal. Changes in serum runt-related transcription factor 2 levels after a 6-month treatment with recombinant human parathyroid hormone in patients with osteoporosis [J]. Endocrinol Invest，2012, 35(6): 602-606.

(2015-06-11收稿2015-12-28修回)

(責任編輯郭青)

Effect of microgravity simulated by mouse tail-suspension on bone

LI Yu1, ZHANG Xinhang2, ZHU Lei1, LI Jun1, and SUN Minlin1.

1.Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Logistical College of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China;2. Department of Biochemistry and Molecular Biology of Logistical College of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162,China

ObjectiveTo study the effect of microgravity on the bone itself and metabolism.Methods8-week-old widetype C57 mice were tail-suspended for 0, 2, 4, weeks. Related serum biochemical indices (Ca2+, ALP, BGP) were measured. Microstructure of bone was observed by micro-CT scanning. Three point bending test on the femurs by material testing machine helped to compare the changes of mechanical parameters. All the data were analysed.by SPSS18.0.ResultsCompared with control group, tail-suspended groups had a higher concentration in calcium in serum,the values of which were (2.134±0.08114) mmol/L, (2.261±0.07913) mmol/L, and (2.388±0.06112) mmol/L; lower levels of serum ALP and BGP, the difference was significant with a longer tail-suspension. The values of ALP was (4.598±0.4783) U/100 ml, (3.447±0.3930) U/100 ml, and (3.142±0.3280) U/100 ml; and the values of BGP were (8.529±0.5233) ng/ml, (8.108±0.3920) ng/ml, and (7.832±0.2821) ng/ml, which had statistically significant difference compared with control group (P<0.05).The scanning of femur showed obviously osteoporosis in tail-suspended mice. Compared with control group, number of bone trabecular reduced, the gap between them widened, thickness decreased simultaneously in the tail-suspended mice. Among which, BV/TV decreased most, the values of tailed-suspension for 2 and 4 weeks were 47.3% and 14.3% in the control group; There was a positive relationship between the osteoporosis and the time of tail-suspension. Mechanical parameters showed that the force decreased as well. Simulated microgravity promoted the loss of calcium in bone, mechanical properties of femurs of suspended-mice decreased, their capability of resistance to force decreasedas well. The forces to bone fracture in tailed-suspension for 0, 2 and 4 weeks were (6.220±0.482)mJ, (4.395±0.301)mJ, and (2.855±0.425)mJ, which had statistically significant difference compared with control group (P<0.05).ConclusionsSimulated microgravity promotes the loss of calcium in bone, which can lead to osteoporosis, and the degree of that has a positive relationship to the time.

microgravity; tail suspension; osteoporosis; mouse

李煜，碩士研究生。

1.300162天津，武警后勤學院附屬醫院脊柱一科，2.300309天津，武警后勤學院分子生物教研室

孫明林, E-mail：sunmlren@sohu.com

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