攜帶blaNDM-1基因革蘭陰性桿菌的分子流行病學研究

李 軍， 鄒明祥， 王海晨， 胡詠梅， 豆清婭， 晏 群， 劉文恩

·論著·

攜帶blaNDM-1基因革蘭陰性桿菌的分子流行病學研究

李 軍， 鄒明祥， 王海晨， 胡詠梅， 豆清婭*， 晏 群， 劉文恩

目的 了解臨床分離碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌中blaNDM-1基因的分布，探討NDM-1陽性菌株的分子流行病學特征。方法 收集長沙地區2011年1月—2012年8月臨床分離非重復碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌，聚合酶鏈反應（PCR）技術篩查blaNDM-1基因，擴增產物測序和BLAST軟件分析。對blaNDM-1基因陽性菌株，采用E試驗法檢測其藥物敏感性、PCR法檢測β內酰胺酶基因（包括blaDHA、blaVIM、blaIMP、blaGIM、blaCTX-M、blaKPC、blaTEM和blaSHV等）和16S rRNA甲基化酶基因、脈沖場凝膠電泳（PFGE）及多位點序列分型（MLST）技術進行分子生物學分型。結果 共收集到687株碳青霉烯類不敏感的革蘭陰性桿菌，其中3株被證實為blaNDM-1基因陽性菌株，包括2株肺炎克雷伯菌（菌株編號CS11495和CS610）和1株陰溝腸桿菌（菌株編號CS30754）。該3株菌均來源于湘雅醫院。在測試的12種抗菌藥物中，除對阿米卡星和多黏菌素B敏感外，對其余抗菌藥物幾乎全耐藥。菌株CS11495同時檢出blaSHV-12、blaTEM-1、blaCTX-M-15和blaIMP-4，菌株CS610攜帶blaDHA、blaSHV-12和blaTEM-1，菌株CS30754中blaSHV-12和blaTEM-1基因陽性。其余基因均為陰性。2株肺炎克雷伯菌PFGE分型可分為A、B兩型。MLST顯示，菌株CS11495、CS610和CS30754分別屬于ST629、ST490及ST214，其中ST490為國內首次報道。結論 blaNDM-1陽性菌株具有廣泛的耐藥譜，與其同時攜帶多種耐藥基因有關。盡管本地區不存在克隆傳播，但分布于同一醫院的不同科室，應預防其播散。

革蘭陰性桿菌； blaNDM-1基因； β內酰胺酶基因； 16S rRNA甲基化酶基因； 脈沖場凝膠電泳； 多位點序列分型

2009年，YONG等［1］在臨床分離的1株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌中首次檢出blaNDM-1基因。該基因屬于β內酰胺酶基因Ambler分子分類中的B類，即金屬酶基因。由于攜帶該金屬酶基因的菌株對目前臨床常用抗菌藥物幾乎全耐藥而被稱作“超級細菌”。近期研究發現，該基因大多存在于接合性的質粒上，可通過接合的方式在同種菌甚至不同種菌中傳播，嚴重威脅著人類的健康［2-3］。

本課題組前期在本院已檢出1株blaNDM-1基因陽性的肺炎克雷伯菌。為進一步明確長沙地區攜帶blaNDM-1基因革蘭陰性桿菌的分子流行病學特征，此次擬采用PCR法對收集的菌株進行blaNDM-1基因篩查，并對陽性菌株檢測其他耐藥基因并作藥敏試驗，同時采用脈沖場凝膠電泳（PFGE）和多位點序列分型（MLST）對其進行分子生物學分型。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 687株非重復革蘭陰性桿菌來源于2011年1月—2012年8月長沙地區6所綜合性醫院（湘雅醫院、湘雅三醫院、長沙市第一人民醫院、長沙市第三人民醫院、湖南省第二人民醫院和長沙市第四人民醫院）的臨床分離菌株，

1.1.2 試劑和儀器 水解酪蛋白瓊脂、藥敏紙片和E試驗紙條均購自英國OXOID公司；低熔點瓊脂糖購于Sangon公司；限制性內切酶XbaI、蛋白酶K、SDS-TE緩沖液、TE緩沖液、TBE液均購自Promega公司；PFGE所用質控菌株（沙門菌H9812）為中國CDC傳染病所呼吸道實驗室所贈。VITEK-2全自動微生物分析系統（法國生物梅里埃公司）；凝膠成像儀為VL（ViberLourmat）系統；脈沖場凝膠電泳儀為Bio Rad CHEF Mapper XA系統。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥敏試驗 用紙片擴散法檢測收集到的革蘭陰性桿菌對亞胺培南和美羅培南的敏感性。PCR法篩查亞胺培南和（或）美羅培南中介和（或）耐藥菌株中的blaNDM-1基因陽性的菌株，相關的操作參照文獻［4］。NDM-1陽性菌株藥敏試驗除慶大霉素采用VITEK-2法檢測外，其余抗菌藥物包括氨曲南、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林、阿米卡星、環丙沙星、哌拉西林-他唑巴坦及多黏菌素B均采用E 試驗法進行檢測。大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853作同步質控。藥敏結果的判斷參照CLSI 2014 M100-S24標準［5］。多黏菌素B的結果判斷參照EUCAST 標準（http：//www.eucast. org/），即MIC≤2 mg/L 為敏感，MIC＞2 mg/L為耐藥。

1.2.2 耐藥基因檢測 對blaNDM-1基因陽性菌株采用PCR法檢測其他β內酰胺酶基因（包括blaDHA、blaVIM、blaIMP、blaGIM、blaCTX-M、blaKPC、blaTEM和blaSHV等）和16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA），引物參照文獻［6-7］，見表1。25 μL PCR反應體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板1.0 μL、無菌雙蒸水9.5 μL。PCR反應條件：預變性94 ℃，5 min；94 ℃變性30 s→退火（退火溫度見表1） 30 s→72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后72 ℃再延伸7 min。擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳100 V、40 min后，用凝膠成像系統觀察結果并拍照分析。PCR陽性產物送上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果采用BLAST（www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST）比對分析。

1.2.3 PFGE 以沙門菌H9812作質控菌株，主要通過菌落收集、凝膠包埋、溶菌酶與蛋白酶K消化、限制性內切酶XbaI酶切、電泳、成像等步驟處理。電泳條件：0.5×TBE緩沖液、溫度12 ℃、電場夾角120°，電壓5.5 V/cm、脈沖時間0.5～12 s 16 h，20～30 s 7 h，30～70 s 2 h。電泳后，EB染色30 min，以GelDoc2000凝膠成像系統成像。PFGE結果解釋參照相關文獻［8］。

1.2.4 MLST PCR擴增肺炎克雷伯菌的7個管家基因（rpoB、 gapA、 mdh、 pgi、 phoE、infB、 tonB）， 引物序列及退火溫度均參照http：//bigsdb.web.pasteur. fr/klebsiella/primers_used.html；產物測序，將序列與數據庫中儲存的序列比對，確定其等位基因譜型及菌株序列型（ST型）。PCR擴增陰溝腸桿菌的7個管家基因（dnaA、 fusA、 gyrB、 leuS、 pyrG、 rplB和rpoB），引物信息參照http：//pubmlst.org/ecloacae/ info/E_cloacae_primers.pdf；產物測序，將序列與數據庫中儲存的序列比對，確定其等位基因譜型及菌株序列型（ST型）。

表1 PCR反應所用引物Table1 Primers used in PCR amplification of relevant genes

2 結果

2.1 菌種分布及碳青霉烯類耐藥模式

687株碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌主要為鮑曼不動桿菌（551株，80.2 %），銅綠假單胞菌（111株，16.2 %），其余依次為大腸埃希菌（7株，1.0 %）、肺炎克雷伯菌（7株，1.0 %）、陰溝腸桿菌（5株，0.6 %）、惡臭假單胞菌（3株，0.4 %）、臭鼻克雷伯菌（1株，0.2 %）、弗勞地枸櫞酸桿菌（1株，0.2 %）和奇異變形桿菌（1株，0.2 %）。

根據革蘭陰性桿菌對亞胺培南和美羅培南的敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）進行統計，687株碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌分為3種耐藥模式：亞胺培南耐藥、美羅培南耐藥為IRMR（682株，99.3 %），亞胺培南耐藥、美羅培南中介IRMI（4 株，0.6 %），亞胺培南耐藥、美羅培南敏感IRMS（1 株，0.2 %）。比例由高到低依次為IRMR、IRMI、IRMS。

2.2 blaNDM-1基因篩查

通過PCR篩查、擴增產物測序以及與GenBank上已報道的基因序列比對，最終證實為blaNDM-1基因陽性的菌株共有3株，包括2株肺炎克雷伯菌（菌株編號CS11495和CS610）和1株陰溝腸桿菌（菌株編號CS30754）。本研究并未在其他類型菌株中檢出blaNDM-1基因，包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌以及大腸埃希菌等。該3株菌均分離自湘雅醫院，菌株CS610分離自脊柱外科，菌株CS11495為新生兒科，菌株CS30754來源于燒傷科。該3株菌的標本來源為痰液和傷口分泌物，見表2。攜帶菌株CS11495的患者和菌株CS30754的患者均治療痊愈，攜帶菌株CS610的患者主動放棄了治療。

表2 blaNDM-1陽性菌株的臨床流行病學和基因型特征Table2 Clinical epidemiological and genotypic characteristics of blaNDM-1positive isolates

2.3 blaNDM-1陽性菌株的藥敏結果

藥敏結果顯示，3株blaNDM-1陽性的菌株對12種被檢測的抗菌藥物幾乎全耐藥。菌株CS11495和CS30754僅對阿米卡星和多黏菌素B敏感，對其余抗菌藥物均耐藥。菌株CS610除對阿米卡星和多黏菌素B敏感外，還對慶大霉素和環丙沙星敏感。見表3。

2.4 其他耐藥基因檢測

blaNDM-1基因陽性的菌株同時攜帶多種其他耐藥基因。菌株CS11495同時攜帶blaSHV-12，blaTEM-1，blaCTX-M-15和blaIMP-4，而菌株CS610攜帶blaDHA，blaSHV-12和blaTEM-1，菌株CS30754同時檢測出blaSHV-12和blaTEM-1基因。3株blaNDM-1基因陽性的菌株中，blaKPC基因和6種16S rRNA甲基化酶基因均為陰性，見表2。

2.5 PFGE

PFGE結果顯示，肺炎克雷伯菌CS11495及CS610為兩種不同的型別，A型和B型，見圖1和表2。

2.6 MLST

MLST顯示，2株肺炎克雷伯菌為2種ST型，菌株CS11495為ST629，菌株CS610為ST490。菌株CS30754型別為ST214，見表2。

表3 3株攜帶blaNDM-1基因菌株對抗菌藥物的敏感性Table3 Susceptibility of three blaNDM-1positive strains to antimicrobial agents

圖1 2株肺炎克雷伯菌PFGE凝膠電泳圖Figure 1 Pulsed-field gel electrophoresis patterns of the two blaNDM-1-positive K. pneumoniae strains

3 討論

碳青霉烯類抗生素是治療革蘭陰性桿菌嚴重感染的最有效藥物之一。然而，近年來隨著該類抗生素在臨床上的廣泛使用，革蘭陰性桿菌對其敏感性逐漸下降。研究顯示產生金屬酶是導致其耐藥的重要機制。金屬酶基因包括blaVIM、blaIMP、blaSPM和blaNDM-1等，其中blaNDM-1基因為新近發現的金屬酶基因。自首株blaNDM-1基因陽性菌株在印度被報道以來［1］，世界上已有多個國家或地區有其檢出的報道［9-12］。國內，2010年3月從寧夏一所醫院出生的2名新生兒的糞便中分離到2株攜帶blaNDM-1基因的屎腸球菌，為國內首次報道blaNDM-1基因陽性的菌株［13］。隨后，在云南、河北等多個地區亦有檢出的報道［14-16］。

本課題組前期在本地區某醫院從1名新生兒患者的痰標本中分離到1株blaNDM-1基因陽性的肺炎克雷伯菌［17］，并且該基因已注冊GenBank，登錄號為JQ757003，該株菌為中國分離的首株blaNDM-1陽性的肺炎克雷伯菌，說明本地區已存在blaNDM-1陽性的菌株。為明確本地區blaNDM-1基因陽性革蘭陰性桿菌的分子流行病學情況，本課題組對本地區6所醫院2011年1月—2012年8月臨床分離碳青霉烯類不敏感革蘭陰性桿菌中攜帶blaNDM-1基因菌株進行了相關的研究。共檢出2株blaNDM-1陽性的肺炎克雷伯菌（菌株編號CS11495和CS610）和1株blaNDM-1陽性的陰溝腸桿菌（菌株編號CS30754）。其中菌株CS610分離自一頸椎外傷患者，該患者行頸椎后路椎管擴大減壓枕頸融合術后第5天，出現間歇發熱，取傷口分泌物作培養，結果為肺炎克雷伯菌，根據藥敏結果采用左氧氟沙星治療，經治療后患者癥狀有所緩解，因家庭原因放棄繼續留院治療，轉入當地醫院救治。菌株CS30754分離自一全身硝火燒傷患者，經過積極的抗感染治療患者痊愈出院。有研究顯示，去過印度旅游是獲得攜帶blaNDM-1基因菌株的高危因素之一。然而，本研究中的患者均無去過印度的經歷，更無與blaNDM-1陽性菌株患者的接觸史，推測可能來源于周圍環境等。

藥敏結果顯示該3株菌除了對多黏菌素B和阿米卡星敏感外，對其余抗菌藥物幾乎全耐藥。之前的一些報道稱攜帶blaNDM-1基因的菌株除了對氨曲南以外的β內酰胺類抗生素均耐藥，而本研究中的3株陽性菌株不僅對包括氨曲南在內的所有β內酰胺類抗生素耐藥，菌株CS30754還對氨基糖苷類抗菌藥物（慶大霉素）和氟喹諾酮類抗菌藥物（環丙沙星）耐藥。推測可能同時存在其他耐藥機制。為此，本研究檢測其他β內酰胺酶基因（包括blaDHA、 blaVIM、 blaIMP、 blaGIM、 blaCTX-M、blaKPC、blaTEM和blaSHV等），結果發現，blaNDM-1基因陽性的菌株同時攜帶多種其他β內酰胺酶基因，如blaSHV-12、 blaTEM-1、 blaIMP-4、 blaCTX-M-15和blaDHA等。值得注意的是所有blaNDM-1基因陽性的菌株中blaKPC基因均為陰性，與目前國內的報道一致［18］。然而，國外已經出現了同時攜帶2種不同類型碳青霉烯酶基因的菌株，如blaNDM-1和blaKPC等［19］。同時，本研究還對16S rRNA甲基化酶基因包括armA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD等進行了檢測。結果發現，16S rRNA甲基化酶基因均為陰性，說明16S rRNA甲基化酶并不是導致其對慶大霉素耐藥的機制。

近年來，blaNDM-1基因陽性菌株已在部分地區存在克隆傳播［20］。然而，本研究中2株blaNDM-1基因陽性的肺炎克雷伯菌PFGE分型屬于不同的型別，說明本地區暫不存在blaNDM-1基因陽性菌株的克隆傳播。MLST結果顯示，菌株CS11495屬于 ST629，與寧長秀等［21］的報道一致，而菌株CS610屬于ST490，為國內首次報道。2株blaNDM-1基因陽性的肺炎克雷伯菌分別屬于2個不同的ST型別，進一步說明本地區blaNDM-1陽性菌株為散發形式存在。但值得注意的是，3株陽性菌株均源于同一所醫院的不同科室。因此，應該采取相應的措施預防和控制其進一步播散及流行。

綜上所述，本研究共檢出3株blaNDM-1陽性菌株，說明本地區已存在該基因陽性的菌株。攜帶blaNDM-1基因的菌株具有廣泛的耐藥譜，與其同時攜帶多種耐藥基因有關。盡管本次研究中并未發現本地區blaNDM-1基因陽性菌株存在克隆流行，但陽性菌株分布在同一醫院的不同科室，應引起臨床和醫院感控部門的高度重視。

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Molecular characterization and prevalence of blaNDM-1metallo-β-lactamase gene in carbapenem non-susceptible gram-negative bacilli

LI Jun， ZOU Mingxiang， WANG Haichen， HU Yongmei， DOU Qingya， YAN Qun， LIU Wenen.
（Department of Laboratory Medicine， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha 410008， China）

Objective To investigate the molecular characterization and prevalence of blaNDM-1positive isolates in carbapenem non-susceptible gram-negative bacilli. Methods Carbapenem non-susceptible gram-negative isolates were collected from January 2011 to August 2012 in Changsha area. The blaNDM-1gene was detected by PCR method. The positive products were sequenced and analyzed with BLAST. Then， antimicrobial susceptibility of blaNDM-1positive isolates were determined by E-test. Other β-lactamase genes and 16S rRNA methylase genes were identified by PCR method， including blaDHA， blaVIM， blaIMP， blaGIM， blaCTX-M， blaKPC， blaTEMand blaSHV. Finally， those blaNDM-1positive isolates were typed by pulsed-field gel electrophoresis （PFGE） and multilocus sequence typing （MLST）. Results A total of 687 carbapenem non-susceptible gram-negative isolates were collected. Three isolates were confirmed as blaNDM-1positive isolates， including two K. pneumoniae isolates and one E. cloacae. All the three strains were derivedfrom Xiangya Hospital. To the 12 antibiotics tested， those blaNDM-1positive isolates were susceptible to only amikacin and polymyxin B. One K. pneumoniae strain CS11495 was found carrying blaSHV-12， blaTEM-1， blaCTX-M-15and blaIMP-4， while the other strains harbored blaDHA， blaSHV-12and blaTEM-1. E. cloacae strain CS30754 was positive for blaSHV-12and blaTEM-1. The two K. pneumoniae isolates were grouped into two types（type A and B） by PFGE. MLST results showed that CS11495，CS610 and CS30754 strains belonged to ST629， ST490 and ST214， respectively. ST490 was reported for the first time in China. Conclusions The pan-drug resistance of blaNDM-1positive strains may be associated with the co-existence of multiple resistance genes. The blaNDM-1positive strain was identified in different departments of this hospital， although no clonal spread was found. Therefore， care should be taken to prevent the outbreak of this pathogen.

gram-negative bacillus； blaNDM-1gene； β-lactamase gene； 16S rRNA methylase gene； pulsed-field gel electrophoresis； multilocus sequence typing

R378

A

1009-7708（2016）04-0631-06

10.16718/j.1009-7708.2016.04.019

2015-10-22

2015-11-30

湖南省發改委（湘發改高技［2012］1493號；湘發改投資［2014］658號）；湖南省自然科學基金（14JJ7003）。

中南大學湘雅醫院檢驗科，長沙 410008； *醫院感染控制中心。

李軍（1984—），男，碩士，檢驗師，主要從事細菌耐藥機制研究。

鄒明祥， E-mail：zoumingxiang@126.com。