兒童患者中分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌分子流行病學分析及耐藥機制研究

祝俊英， 王 春， 孫 燕， 胡付品， 張 泓

·論著·

兒童患者中分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌分子流行病學分析及耐藥機制研究

祝俊英1， 王 春1， 孫 燕1， 胡付品2， 張 泓1

目的 研究兒童患者中分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌 （CRKP）的流行特征及耐藥機制。方法 收集2013年1－12月上海市兒童醫院臨床微生物室分離的12株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，采用瓊脂稀釋法檢測其對常用抗菌藥物的耐藥性，乙二胺四乙酸（EDTA）協同試驗和3'-氨基苯硼酸（APB）協同試驗進行碳青霉烯酶表型分析，PCR擴增及DNA測序進行碳青霉烯酶基因型確證，接合試驗檢測碳青霉烯酶耐藥基因是否位于質粒上，脈沖場凝膠電泳（PFGE）和多位點序列分型（MLST）檢測菌株間基因相關性。結果 12株CRKP對多黏菌素E均敏感，對頭孢菌素類耐藥率均為100%，對亞胺培南、美羅培南和厄他培南耐藥率分別為91.7%、91.7%和100%。PCR及DNA測序顯示12株CRKP中8株產KPC-2，1株產NDM-1，3株未檢出碳青霉烯酶。將12株CRKP與大腸埃希菌J53進行接合，獲得3株接合子。PFGE分型顯示，12株CRKP可分為4個型3個亞型。MLST結果顯示，8株blaKPC陽性肺炎克雷伯菌均為ST11型，1株blaNDM-1陽性肺炎克雷伯菌為ST278，3株不產碳青霉烯酶菌分別為ST76、ST37、ST610。結論 產KPC-2型碳青霉烯酶是該院分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制，產NDM-1陽性的肺炎克雷伯菌已在該院出現。

兒童； 碳青霉烯酶； 肺炎克雷伯菌

碳青霉烯類是臨床治療多重耐藥腸桿菌科細菌感染的有效抗生素。該類藥物在臨床上的廣泛使用使細菌不可避免的產生了耐藥性，產碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制［1］。自2001年美國報道第1株產KPC型碳青霉烯酶耐藥菌后，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae， CRE）在全球被廣泛報道［2］。2009年，YONG等［3］在1例有過印度住院史的瑞典人尿液中檢出第1株產新德里金屬β內酰胺酶（NDM）的腸桿菌科細菌，此后，該類菌株在全球廣泛播散并引起暴發流行。2013年，HU等［4］在江西檢出我國大陸地區第1株產NDM-1腸桿菌科細菌。產KPC酶和NDM-1酶的腸桿菌科細菌感染給患者健康造成極大的威脅。本研究對上海市兒童醫院兒童患者分離的CRE進行研究，以了解CRE在兒童患者中的流行特征及耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌來源 收集上海市兒童醫院2013年1－12月臨床分離的12株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）作為研究對象。CRKP定義為對亞胺培南、美羅培南或厄他培南中任一藥物耐藥者。

1.1.2 培養基 藥敏試驗用MH瓊脂，接合試驗用MH肉湯，均購自英國OXOID公司。

1.1.3 抗菌藥物 抗菌藥物標準品購自上海市藥品檢驗所。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 參照2014年CLSI推薦的瓊脂稀釋法測定12株CRKP對14種抗菌藥物的敏感性，大腸埃希菌ATCC 25922為質控菌株。藥敏試驗結果中，除多黏菌素E和替加環素按照EUCAST折點判斷標準外，其他藥物均按照CLSI 2014版折點標準判讀。

1.2.2 碳青霉烯酶表型及基因型檢測 使用無菌生理鹽水將待測菌調至0.5麥氏單位，用棉簽將菌液均勻涂布于MH平皿上，用鑷子在MH平皿上均勻地貼3張厄他培南紙片，第1張紙片滴加0.1 mol/L二胺四乙酸（EDTA）溶液10 μL，第2張滴加50 mg/mL的3'- 氨基苯硼酸（APB）6 μL，第3張不做任何處理。35℃過夜培養后觀察結果，加有EDTA的厄他培南紙片與未做任何處理的紙片抑菌圈直徑相差≥5 mm提示為產金屬酶菌株。加APB的厄他培南紙片與未做任何處理紙片抑菌圈直徑相差≥5 mm為產KPC酶菌株。

1.2.3 PCR擴增 采用PCR法擴增碳青霉烯酶（KPC、NDM-1、IMP、VIM、AIM、SPM、GIM、BIC、SIM、DIM）、AmpC酶（MOX、CIT、DHA、ACC、EBC、FOX）、 ESBL（CTX-M）耐藥基因，所用引物參考文獻 ［5-7］。陽性產物測序后在美國國立生物技術信息中心（NCBI）上BLAST進行比對。

1.2.4 接合試驗 選用疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53作為受體菌，產碳青霉烯酶菌作為供體菌進行質粒接合試驗。供體菌和受體菌分別在MH肉湯中培養后，按照1∶1混合后加于新鮮的MH肉湯中，置于35℃靜置孵育6 h后，取100 μL混合液均勻地涂布在含有150 μg/mL疊氮鈉和0.25 mg/L厄他培南的MH篩選平皿上，在含藥平皿上挑取單個菌落接種于CHROMagar顯色平皿上判斷是否為接合子，對疑似接合子進行PCR擴增及藥敏試驗，判斷接合試驗是否成功。

1.2.5 脈沖場凝膠電泳（PFGE） 采用PFGE對12株CRKP進行同源性分析，菌株經XbaI酶切后包埋于1%瓊脂糖凝膠中，在無硫脲的含有0.5×Tris-硼酸（TBE）緩沖液中進行脈沖場電泳，沙門菌H9812為參考菌株。酶切圖譜按照美國CDC TENOVER等［8］推薦的方法判讀。

1.2.6 多位點序列分型（MLST） 采用PCR擴增12株CRKP 7個管家基因：ropB，gapA， mdh， pgi，phoE， infB， tonB， 引物參見網站（http：//bigsdb.web. pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html），擴增產物經過測序后與網站標準序列進行比對。

1.2.7 數據分析 使用WHONET 5.6對MIC結果進行分析。

2 結果

2.1 藥敏試驗

12株CRKP對14種常用抗菌藥物的藥敏試驗結果見表1。12株CRKP對多黏菌素E全部敏感；對頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢西丁和氨曲南率耐藥，對亞胺培南、美羅培南和厄他培南耐藥率分別為91.7%（11/12）、91.7%（11/12）、100%（12/12），對阿米卡星和環丙沙星耐藥率均為83.3%（10/12），對頭孢哌酮-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦耐藥率均為91.7%（11/12）。

2.2 碳青霉烯酶表型和基因型

12株CRKP中8株blaKPC-2陽性，1株blaNDM-1陽性，3株未檢出碳青霉烯酶基因，12株CRKP中有10株為blaCTX-M陽性。而其他碳青霉烯酶及AmpC酶基因在12株CRKP中均未檢測到。APB協同試驗和EDTA協同試驗表型和基因型檢測的符合率分別為6/8和1/3，見表2。

表1 12株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌及接合子MIC值Table1 MIC of 12 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae and transconjugants

表2 12株碳青酶烯類耐藥肺炎克雷伯菌 β內酰胺酶表型、基因型和MLST結果Table2 The phenotypic and genetic results of β-lactamase and MLST of 12 CRKP

2.3 CRKP耐藥基因水平傳播及分子流行病學

2.3.1 接合試驗 將已明確碳青霉烯酶基因的9株細菌與受體菌J53接合后，共獲得3株接合子，分別為56-J53、238-J53、278-J53，接合子與受體菌相比，對抗菌藥物MIC明顯升高，見表1。

圖1 12株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌經脈沖場凝膠電泳后所得聚類分析樹狀圖Figure 1 Dendrogram obtained from pulsed-field gel electrophoresis （PFGE） profiles of XbaI-digested genomics DNAs from 12 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates

2.3.2 分子流行病學檢測（PFGE、MLST） PFGE將12株CRKP分為4個型3個亞型（A1、A2、A3、B、C、D），12株CRKP的樹狀圖分析見圖1，主要來源于新生兒病房（41.7%，5/12）、綜合病房（多為棄嬰）（25.0%，3/12）及重癥監護病房（16.7%， 2/12）。對12株CRKP 7個管家基因進行擴增、測序并與網站內已建立的標準進行比對，12株CRKP主要分為ST11、ST37、ST278、ST610、ST76 5種ST型別，見圖1。

3 討論

碳青霉烯類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強等特點，是治療多重耐藥腸桿菌科細菌感染的最后一道防線。近年來，其在臨床的使用增多使CRE不斷增多，2008－2013年CHINET監測數據顯示腸桿菌科細菌中碳青霉烯類耐藥菌株的檢出率由2008年的＜1%升至2013年的＜7%，臨床分離的CRE以肺炎克雷伯菌為主［9-10］。CRE感染性疾病具有高發病率和高病死率的特性，兒童患者由于基礎免疫力較低更容易感染CRE［11］。因此，研究兒童患者中CRE的流行特征和耐藥機制非常重要，我國對于兒童患者CRE流行的數據相對較少，本研究針對2013年1－12月上海市兒童醫院收集的12株CRKP進行研究。

12株CRKP多為多重耐藥菌，對多黏菌素E均敏感，其次為替加環素、阿米卡星和環丙沙星，耐藥率均為16.7%。CRKP對阿米卡星和環丙沙星耐藥率較低的原因可能是這2種藥物特定不良反應而少用或禁用于兒童。替加環素作為近年國內剛上市的甘氨環素類藥物，其耐藥菌株的出現應引起臨床廣泛重視。總之，多重耐藥菌的出現及有限的抗菌藥物選擇給臨床抗感染治療造成了更大的挑戰，及時監測耐藥菌的流行播散，并采取相應防控措施極為重要。

目前，國內外報道最多的碳青霉烯酶是KPC型，本研究收集了2013年兒童患者體內分離的12株CRKP，發現上海市兒童醫院患兒中分離的肺炎克雷伯菌所產碳青霉烯酶與成人相同，主要產KPC-2型，占75.0 %。值得注意的是，我們發現1株產NDM-1酶的肺炎克雷伯菌，NDM-1最初發現于印度和巴基斯坦等南亞地區，此后因跨國醫療和旅游而在全球各地播散。自2013年江西檢出第1株NDM-1型肺炎克雷伯菌后，NDM-1在腸桿菌科細菌中檢出在各地區陸續報道，2015年湖南和山東各報道了一次產NDM-1肺炎克雷伯菌在新生兒病房和新生兒重癥監護病房（NICU）的流行［12-13］。但北京地區兒童患者分離的CRKP以產KPC和IMP-4型金屬酶為主，不同地區CRKP產生的碳青霉烯酶類型不同，可能與各地區使用抗菌藥物種類不同有關［14］，及時監測耐藥菌變遷以防止其大范圍流行非常迫切。本研究發現2株CRKP（KP8，KP423）表型試驗和基因型檢測均為陰性，其耐藥機制可能是膜孔蛋白丟失合并產ESBL或AmpC酶；此外，有2株（KP248，KP390）EDTA協同試驗陽性的CRKP也未檢出金屬碳青霉烯酶，推測可能是某種金屬酶的變異體或新型金屬碳青霉烯酶導致細菌耐藥，其耐藥機制還需進一步研究闡明。

MLST結果顯示，12株CRKP以ST11為主，這與國內其他研究相似，另外還有ST37、ST278、ST610、ST76的出現。PFGE同源性分析顯示產KPC-2的肺炎克雷伯菌ST11型具有較高的同源性，3株產KPC型和NDM-1型酶的CRKP可通過接合試驗與大腸埃希菌J53接合，證明碳青霉烯酶基因位于可移動質粒或基因元件上，可導致耐藥基因在細菌間水平傳播。及時監測耐藥菌出現以避免耐藥菌大范圍暴發流行意義重大。

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Molecular epidemiology and mechanism of resistance of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in pediatric patients

ZHU Junying， WANG Chun， SUN Yan， HU Fupin， ZHANG Hong.
（Department of Laboratory Medicine，Shanghai Children's Hospital， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200040， China）

Objective To characterize the epidemiology and resistance mechanism of the carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae （CRKP） strains isolated from pediatric patients. Methods A total of 12 CRKP strains were isolated in Shanghai Children's Hospital from January to December in 2013. Antimicrobial susceptibility testing was conducted by agar dilution method. The phenotypes of carbapenemase-producing strains were identifed by 3'-aminophenylboronic acid （APB） or EDTA synergy test. Resistance determinants were detected by PCR and DNA sequencing. Conjugation experiment was used to determine whether the carbapenemase genes were located in mobile plasmids. Clonal relatedness was identified by pulsed field gel electrophoresis（PFGE） and multiple locus sequence typing （MLST）. Results All the 12 CRKP strains were susceptible to colistin but all resistantto cephalosporins and ertapenem. Overall 91.7% （11/12） of the strains were resistant to both imipenem and meropenem. PCR and DNA sequencing analysis confirmed that 8 isolates produced blaKPC-2and 1 isolate produced blaNDM-1. Carbapenemase-related genes were not found in the remaining 8 strains. The plasmids harboring resistance genes were successfully transferred from 3 of the 12 strains to Escherichia coli J53. The PFGE results showed that the 12 strains of K. pneumoniae were classified into five types and three subtypes. MIST results showed that all the 8 strains of KPC-2carbapenemase-producing K. pneumoniae were ST11 and 1 NDM-1-producing K. pneumoniae strain was ST278， while the remaining 3 isolates belonged to ST76， ST37， ST610， respectively. Conclusions KPC-2 production is one of the mechanisms of carbapenem resistance in K. pneumoniae in the pediatric patients of this hospital. NDM-1-producing K. pneumoniae is emerging in this hospital.

children； carbapenemase； Klebsiella pneumoniae

R378. 996

A

1009-7708 （ 2016） 05-0578-05

10.16718/j.1009-7708.2016.05.009

2015-11-09

2015-12-10

上海衛計委重點學科－傳染病與衛生微生物學（15GWZK0101）；上海市衛生計生系統重要薄弱學科建設（2015ZB0203）。

1.上海市兒童醫院，上海交通大學附屬兒童醫院檢驗科，上海 200040；

2. 復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所。

祝俊英（1988—），女，碩士研究生，主要從事細菌耐藥機制及分子流行病學研究。

張泓，E-mail：zhanghong3010@126.com。