血液分離高黏液表型肺炎克雷伯菌的毒力基因檢測及生物膜形成測定

魏丹丹， 李喜紅， 王蓮慧， 劉 洋， 萬臘根， 鄧 瓊， 徐群飛， 王貴明

·論著·

血液分離高黏液表型肺炎克雷伯菌的毒力基因檢測及生物膜形成測定

魏丹丹， 李喜紅， 王蓮慧， 劉 洋， 萬臘根， 鄧 瓊， 徐群飛， 王貴明

目的 檢測血液分離肺炎克雷伯菌的高黏液（HM）表型、莢膜血清型及主要毒力基因，并測定其生物膜形成情況。方法 收集血源性肺炎克雷伯菌82株，黏液絲試驗檢測HM表型。PCR篩查6種常見高毒力莢膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57）和7種常見毒力基因（rmpA、rmpA2、aerobactin、mrkD、iroN、magA、wcaG），利用微孔板法檢測生物膜的形成。毒力分?jǐn)?shù)（毒力基因個數(shù)）組間比較采用秩和檢驗，率的組間比較采用卡方檢驗。結(jié)果 82株血源性肺炎克雷伯菌中，黏液絲試驗陽性占31.7 %（26/82），高毒力莢膜血清型菌株的陽性率為40.2 %（33/82），二者均陽性24株，陽性率為29.3 %（24/82）， 毒力分?jǐn)?shù)的第50百分位數(shù)P50為2。HM表型與非HM表型菌株中高毒力莢膜血清型的檢出率分別為92.3 %（24/26）和16.1 %（9/56），毒力分?jǐn)?shù)P50分別為5和1，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。高毒力莢膜血清型菌株的毒力分?jǐn)?shù)P50為5.5，高毒力莢膜血清型菌株中，K1/K2/K57型的毒力分?jǐn)?shù)與K5/K20/K54型比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。HM表型菌株和非HM菌株形成生物膜的陽性率分別為50.0 %（13/26）和73.2 %（41/56）， 二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高毒力莢膜血清型菌株形成生物膜的陽性率為60.6 % （20/33），不同高毒力莢膜血清型肺炎克雷伯菌中，K54菌株形成生物膜的能力最強，陽性率為6/8。結(jié)論 致血流感染肺炎克雷伯菌存在多種強毒力和（或）生物膜陽性菌株，必須高度重視，避免廣泛流行。

肺炎克雷伯菌； 高黏液表型； 莢膜血清型； 毒力； 生物膜

肺炎克雷伯菌是臨床常見的條件致病菌之一，能引起呼吸系統(tǒng)感染、尿路感染、軟組織感染等多種感染性疾病，近年來已成為醫(yī)院感染的重要病原菌。目前，肺炎克雷伯菌引起的血流感染已較為常見，是腸桿菌科中僅次于大腸埃希菌的血流感染病原菌［1］。同時，肺炎克雷伯菌也是一種容易形成生物膜的病原菌［2］，生物膜的形成使治療變得非常困難，尤其是留置導(dǎo)管的患者容易發(fā)生導(dǎo)管相關(guān)性血流感染。與其他病原菌一樣，肺炎克雷伯菌有多種致病物質(zhì)，莢膜能夠使細(xì)菌抵抗血清的殺菌作用和中性粒細(xì)胞的吞噬作用，黏附素允許菌體通過吸附進(jìn)入宿主細(xì)胞，鐵攝取系統(tǒng)能使其在宿主的鐵限制環(huán)境中增殖，毒素或其他細(xì)胞外成分產(chǎn)生黏膜損傷，協(xié)助其侵入血液。本研究對我院2014年1－12月血液標(biāo)本中分離的82株肺炎克雷伯菌進(jìn)行實驗室檢測，以明確表型和基因特征。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源

收集我院2014年1—12月血流感染患者送檢的血標(biāo)本，采用VITEK-2 Compact微生物分析儀（法國生物梅里埃公司）對分離到的菌株進(jìn)行鑒定，重復(fù)患者只取1次分離的肺炎克雷伯菌作為本次研究的對象，共分離到82株肺炎克雷伯菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853和肺炎克雷伯菌ATCC 700603，均購于衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 方法

1.2.1 莢膜血清分型及毒力基因檢測 熱裂解法提取菌株DNA。采用PCR方法篩選所有肺炎克雷伯菌的高毒力莢膜血清型基因（K1、 K2、 K5、 K20、K54、 K57）［3］，PCR方法檢測肺炎克雷伯菌的7種常見毒力基因（magA、 rmpA、 rmpA2、 aerobactin、 wcaG、mrkD、iroN），PCR擴增引物、體系和擴增條件參照相關(guān)文獻(xiàn)［3-4］。將陽性擴增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測序并比對分析。菌株攜帶毒力基因的個數(shù)用毒力分?jǐn)?shù)表示［5］。

1.2.2 生物膜體外形成試驗 生物膜體外形成試驗參照文獻(xiàn)［6-7］。 將菌株置于LB培養(yǎng)基中，37?℃震蕩過夜，配成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木?，并用LB肉湯1∶ 100稀釋，稀釋后的肉湯加入96孔聚苯乙烯滅菌微孔板中，200 μL/孔，每株菌接種3孔，以200 μL無菌LB肉湯作為陰性對照。 將微孔板37?℃培養(yǎng)24 h，吸出菌液，用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液洗板3次，晾干后用1 %結(jié)晶紫染色。15 min后將染液吸出，用蒸餾水洗板至無色。 晾干后，用200 μL的無水乙醇充分溶解結(jié)晶紫，轉(zhuǎn)移至新的微孔板中，在570 nm波長下讀取光密度（D）值。測量陰性對照的D值25次，以（x±3s）為陰性對照區(qū)間，大于該值則判定為生物膜形成陽性。

1.2.3 高黏液（hypermucoviscosity， HM）表型檢測 應(yīng)用黏液絲試驗檢測，用接種環(huán)輕觸血瓊脂平皿上過夜培養(yǎng)的新鮮菌落向外牽拉，重復(fù)牽拉2次，若2次均有黏液絲形成并且長度大于5 mm即判為HM表型陽性，即該菌株為HM菌株［8］。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用EXCEL2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件，毒力分?jǐn)?shù)呈偏態(tài)分布，組間比較采用秩和檢驗，率的組間比較采用χ2檢驗或Fisher檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HM表型檢測及血清莢膜分型、毒力基因分 布

82株血源性肺炎克雷伯菌中，黏液絲試驗陽性菌株共26株，陽性率為31.7 %（26/82），高毒力莢膜血清型33株，陽性率為40.2 %（33/82），且主要為K1型（11株，33.3 %）、K2型（7株， 21.2 %）和K54（8株，24.2 %），其余為K5型（1 株，3.0 %）、K20（2株， 6.1 %）和K57（4 株， 12.1 %），其中HM表型與高毒力血清型共陽性24株，陽性率為29.3 %（24/82）。此外，7種毒力基因中檢出率最高為mrkD （93.9 %），其次為aerobactin（40.2 %），其毒力分?jǐn)?shù)為0～7，第25百分位數(shù)（P25）、第50百分位數(shù)（P50）、第75百分位數(shù)（P75）分別為1、2和5，見表1。

表1 HM表型、K分型及毒力基因攜帶Table1 Detection of hypermucoviscous phenotype， capsular serotypes and virulence genes

2.2 HM表型、高毒力莢膜血清型與毒力基因關(guān)系

高毒力莢膜血清型菌株在HM表型與非HM表型菌株中的陽性率分別為92.3 %（24/26）和16.1 %（9/56），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （χ2= 39.801， P＜0.05），K1、K54和K57型是HM表型肺炎克雷伯菌的主要莢膜型，占73.1 %（19/26）。HM表型與非HM表型菌株的毒力分?jǐn)?shù)P50分別為5和1，U值為96.500，P=0.000，且7種毒力基因的檢出率HM表型菌株均大于非HM表型菌株，其中6種（rmpA、rmpA2、aerobactin、iroN、magA、wcaG）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均小于0.01）。高毒力莢膜血清型與非高毒力莢膜血清型菌株的毒力分?jǐn)?shù)P50分別為5.5和1，U值為50.500，P=0.016。 其中高毒力莢膜血清型菌株中，K1/K2/ K57菌株和K5/K20/K54菌株的毒力分?jǐn)?shù)P50分別為6.5和2，U值為48.500，P=0.002，

2.3 HM表型、高毒力莢膜血清型與生物膜形成的關(guān)系

陰性對照的D值區(qū)間為0.073±0.018， D值＞0.091的菌株判定為生物膜形成陽性。82株肺炎克雷伯菌株有54株形成生物膜，陽性率達(dá)65.8 %，HM表型菌株和非HM表型菌株形成生物膜的陽性率分別為50.0 %（13/26）、73.2 %（41/56）， 兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 4.26，P＜0.05），高毒力莢膜血清型與非高毒力莢膜血清型菌株形成生物膜的陽性率分別為60.6 % （20/33）、69.4 %（34/49），差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而不同高毒力莢膜血清型肺炎克雷伯菌中，K54菌株形成生物膜的能力最強，陽性率為6/8，其次為K2菌株，陽性率為4/7。

3 討論

莢膜多糖使肺炎克雷伯菌具有黏液性狀表型，臨床資料表明，具有HM表型的菌株更易引起一些特殊的侵襲性感染，如肝膿腫、腦膜炎、膿胸、眼內(nèi)炎等［9］，若為血流感染，則更易隨血流播散至其他部位，形成多發(fā)性膿腫和嚴(yán)重多臟器功能衰竭，嚴(yán)重危及患者的生命。本試驗參照文獻(xiàn)［8］通過拉絲實驗半定量測定血流感染肺炎克雷伯菌的HM性狀，該方法操作簡單快速，結(jié)果易于判斷，適合臨床微生物實驗室用來描述菌株的特性，結(jié)果在82株肺炎克雷伯菌中，共檢測到HM表型菌株26株，占31.7 %。

莢膜多糖是肺炎克雷伯菌最主要的毒力因子之一，可以使菌體對抗中性粒細(xì)胞吞噬作用，介導(dǎo)菌體逃避宿主的免疫殺傷，同時具有抗血清殺菌作用。目前，已確定有78個莢膜血清型別，其中，Kl、K2、K5、K20、K54和K57型菌株與人類及動物的各種侵襲性感染密切相關(guān)，為高毒力血清莢膜分型肺炎克雷伯菌［10］。本研究中，我們對高毒力血清莢膜基因進(jìn)行擴增，82株血源性肺炎克雷伯菌中，高毒力莢膜血清型菌株的檢出率為40.2 %，HM表型菌株中，高毒力莢膜血清型的檢出率高達(dá)92.3 %，而在非HM表型菌株中，高毒力莢膜血清型的檢出率，僅為16.1 %，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時我們還擴增了7種與莢膜合成、黏附損傷及生長相關(guān)的毒力基因，rmpA和rmpA2基因是一種同源的莢膜多糖合成調(diào)節(jié)基因，二者共同參與菌株黏液性狀的調(diào)控［11-12］，此外，magA基因位于K1莢膜多糖體生物合成區(qū)內(nèi)，是調(diào)控血清型Kl的主要基因［13］，研究表明，敲除rmpA和magA基因，細(xì)菌的HM表型、血清抵抗和細(xì)胞吞噬抗性均降低，致病力也降低［14］。wcaG因子則編碼莢膜多糖中巖藻糖的生物合成，可增強菌體抗巨噬細(xì)胞吞噬作用，與K1和K54血清型密切相關(guān)，其他毒力因子如aerobactin、iroN基因可使細(xì)菌競爭組織中的鐵以增強生存能力［10］；而與菌毛編碼蛋白有關(guān)的mrkD則可促進(jìn)細(xì)菌黏附而增強致病力［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，所有毒力基因的檢出率，HM菌株均大于非HM菌株，其中rmpA、rmpA2、aerobactin、iroN、magA、wcaG差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。以上說明HM表型可作為鑒定臨床分離菌株是否為高毒力菌株的指標(biāo)之一，建議實驗室不僅要開展對肺炎克雷伯菌耐藥性的檢測，還應(yīng)特別注意檢測肺炎克雷伯菌的黏液性狀、莢膜型及毒力基因攜帶，并及時將檢測結(jié)果與臨床溝通。

生物膜是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于有生命體或無生命體表面形成的菌落聚集物，由細(xì)菌和自身分泌的胞外基質(zhì)組成。這類細(xì)菌群體耐藥性強，并可逃避機體免疫系統(tǒng)的吞噬作用，使感染部位難以徹底清除，是臨床上難治性感染的重要原因之一［16］。肺炎克雷伯菌也是易形成生物膜的微生物之一。影響其形成生物膜的因素較多，如莢膜、菌毛、數(shù)量感知系統(tǒng)等，其中菌毛在生物膜形成中起到重要作用，研究證實3型菌毛與生物膜的形成密切相關(guān)，3型菌毛主要由亞單位蛋白TurkA和末端黏附因子mrkD構(gòu)成，黏附因子mrkD可促進(jìn)生物膜的形成［15］。本研究中mrkD基因在肺炎克雷伯菌中分離率高達(dá)93.9 %，mrkD陽性結(jié)果與生物膜的形成情況并不完全吻合，說明生物膜的形成可能與其編碼蛋白的表達(dá)量相關(guān)，或是與其他因素綜合調(diào)控的結(jié)果，具體機制還需進(jìn)一步研究。本研究生物膜形成試驗顯示，HM菌株和非HM菌株形成生物膜的比率均大于50 %，且高毒力莢膜血清型菌株形成生物膜的陽性率高達(dá)60.6 %，生物膜的形成或給臨床高毒力肺炎克雷伯菌的治療帶來新的挑戰(zhàn)，提示臨床一旦發(fā)生肺炎克雷伯菌感染，尤其是HM菌株，還須注意預(yù)防生物膜的形成，避免發(fā)生導(dǎo)管相關(guān)性血流感染。

綜上所述，本地區(qū)致血流感染肺炎克雷伯菌中存在強毒力和（或）生物膜形成陽性的克隆株，必須高度重視，建議開展更廣范圍的監(jiān)測。

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Detection of virulence genes and biofilm formation of Klebsiella pneumoniae strains isolated from blood samples

WEI Dandan， LI Xihong， WANG Lianhui， LIU Yang， WAN Lagen， DENG Qiong， XU Qunfei， WANG Guiming.
（Department of Laboratory Medicine， the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006， China）

Objective To identify the hypermucoviscous （HM） phenotype， capsular serotypes， virulence genes and biofilm formation of Klebsiella pneumoniae strains isolated from blood samples. Methods Eighty-two K. pneumoniae strains were collected from blood samples. The HM phenotype of K. pneumoniae was determined by string test. All the isolates were assessed for six hypervirulent capsular serotypes and seven virulence genes by PCR. Bioflm formation was investigated by using microtiter dish bioflm formation assay. Virulence scores were compared between groups by rank-sum test， while the rates were compared betweengroups by Chi-square test or Fisher exact test. Results Out of the 82 K. pneumoniae strains， 31.7 % （26/82） were HM phenotype. The prevalence of hypervirulent capsular serotype was 92.3 % （24/26）. Overall， 24 （29.3 %） of the 82 strains were both HM phenotype and hypervirulent capsular serotype. The P50 of virulence scores （number of virulence genes） was 2. The prevalence of hypervirulent capsular serotype in HM and non-HM strains was 92.3 % （24/26） and 16.1 % （9/56）， respectively. The P50 of virulence scores was 5 and 1， respectively （bothP ＜?0.05）. The P50 of virulence scores was 5.5 in hypervirulent capsular serotype strains. The virulence scores of serotype K1/K2/ K57 were signifcantly different from that of serotype K5/K20/K54 （P＜0.01）. In addition， bioflm formation was found in 50.0 % of HM strains and 73.2 % of non-HM strains （χ2=4.26， P＜0.05）. Bioflm formation was identifed in 60.6 % （20/33） of the hypervirulent capsular serotype strains. Serotype K54 of the hypervirulent capsular serotype strains was most potent in bioflm formation （6/8）. Conclusions Attention should be paid to the high prevalence of hypermucoviscous and hypervirulent K. pneumoniae phenotypes in the strains isolated from blood samples. Measures should be taken to control the spread of such strains.

Klebsiella pneumoniae； hypermucoviscous phenotype； capsular serotype； virulence； bioflm

R378.996

A

1009-7708（2016）04-0622-05

10.16718/j.1009-7708.2016.04.017

2015-10-08

2015-11-18

江西省教育廳青年基金項目（GJJ14178）；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研項目（2013A035）；江西省衛(wèi)生計生委科技計劃項目（20155140）；江西省科技廳青年基金項目（20151BAB215028）。

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，南昌 330006。

魏丹丹（1987—），女，碩士研究生，檢驗技師，主要從事微生物耐藥及致病機制的研究。

劉洋，E-mail：836872018@qq.com。