應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜檢測產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌對厄他培南的水解能力

李媛睿， 劉婧嫻， 俞 靜， 陳 峰， 劉 瑛

·論著·

應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜檢測產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌對厄他培南的水解能力

李媛睿， 劉婧嫻， 俞 靜， 陳 峰， 劉 瑛

目的 應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）檢測產KPC-2、NDM-1、VIM-2、IMP-1與IMP-4型碳青霉烯酶腸桿菌科細菌水解厄他培南的能力。 方法 收集2009年6月－2013年12月上海交通大學醫學院附屬新華醫院各種臨床標本中分離的耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（CRE），用改良Hodge試驗進行產碳青霉烯酶的表型篩選，用PCR擴增方法檢測其碳青霉烯酶基因，并經測序確認。應用MALDI-TOF MS進行厄他培南水解預試驗以確定最適厄他培南濃度及孵育時間，隨后采用預試驗中的最適條件，應用MALDI-TOF MS檢測CRE水解厄他培南的能力。結果 108株CRE中，有102株改良Hodge試驗陽性，其中90株產KPC-2、4株產NDM-1、3株產VIM-2、2株產IMP-1、2株產IMP-4、1株同時產KPC-2和IMP-4型碳青霉烯酶，且在2 h內均能水解厄他培南；另外6株CRE改良Hodge試驗陰性，未檢測出上述碳青霉烯酶基因，且不水解厄他培南。結論 臨床微生物實驗室應用MALDI-TOF MS能夠快速準確檢測CRE水解厄他培南的能力，篩查產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌，為臨床早期合理使用碳青霉烯類抗生素提供依據。

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜； 產碳青霉烯酶； 腸桿菌科細菌； 厄他培南； 水解能力

碳青霉烯類抗生素是20世紀80年代新研發出的一組廣譜β內酰胺類抗生素，是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌的最后選擇［1］。隨著該類藥物的廣泛使用，美國National Healthcare Safety Network（NHSN）、歐洲European Antimicrobial Resistance Surveillance Network （EARS-Net）和CHINET細菌耐藥監測結果均顯示，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（CRE）逐漸開始在全球蔓延［2-4］，它引起的感染難以治療、死亡率高，已經成為一個重要的公共衛生威脅［1］。腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因之一是產生碳青霉烯酶，目前已發現近100種碳青霉烯酶［5］。因此，快速準確檢測碳青霉烯酶顯得尤為重要與迫切?；|輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）技術用于檢測細菌水解抗生素能力已成為一個研究熱點。本研究應用MALDI-TOF MS檢測產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌水解厄他培南能力的方法，旨在快速篩查產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2009年6月－2013年12月上海交通大學醫學院附屬新華醫院微生物實驗室各種臨床標本分離得到的CRE，剔除同一患者相同部位分離的重復菌株，于-80℃甘油肉湯中保存。另外收集7株對碳青霉烯類抗生素敏感的臨床分離株（肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、大腸埃希菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌和解鳥氨酸拉烏爾菌各1株）。肺炎克雷伯菌ATCC 700603及大腸埃希菌ATCC 25922由上海市臨床檢驗中心提供。

1.1.2 試劑與儀器 厄他培南粉劑（中國，杭州默沙東公司），美羅培南及厄他培南藥敏紙片（英國，OXOID公司），血瓊脂平皿、麥康凱平皿、MH瓊脂平皿（中國，上海伊華公司），VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定/藥敏分析系統和AST-GN13藥敏卡片（法國，Bio Mérieux公司）；Mastercycler Epgradient PCR儀（德國，Eppendorf公司），PCR擴增試劑盒（中國，大連寶生物工程有限公司），PCR引物（中國，上海生工生物工程公司），ABI Prism 310 Genetic Analyzer測序儀及BigDye Terminator v3.1測序試劑盒（美國，Applied Biosystems公司），水平電泳儀與凝膠成像系統（中國，上海天能公司），Microflex LT MALDI-TOF MS儀、基質α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）和Anchorchip 96靶板（德國，Bruker Daltonik公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定、藥敏及改良Hodge試驗 凍存菌種復蘇后，轉種于血瓊脂平皿，35℃孵育18～24 h，用MALDI-TOF MS進行鑒定。用VITEK-2 Compact儀聯合藥敏紙片擴散法（K-B法）對菌株進行藥敏試驗，藥敏判斷標準參照CLSI 2012 版執行標準［6］，并依據美國疾病預防控制中心于2012年頒布的耐碳青霉烯類腸桿菌控制指南篩選出CRE菌株［7］。用改良Hodge試驗進行產碳青霉烯酶的表型篩選，試驗方法與結果判斷參考相關文獻［7］。

1.2.2 耐藥基因檢測 采用PCR方法對108株CRE進行blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaNDM-1、blaGES和blaOXA碳青霉烯酶基因擴增。PCR引物序列、反應體系及條件參照文獻［8-10］。對PCR擴增陽性產物基因測序，具體反應體系與操作流程見參考文獻［11］，測序結果提交NCBI網站進行BLAST分析，確定其基因亞型。

1.2.3 MALDI-TOF MS檢測預試驗 選取10株CRE為預試驗研究對象，包括2株大腸埃希菌（分別產KPC-2、NDM-1），3株肺炎克雷伯菌（分別產KPC-2、NDM-1、IMP-4），3株陰溝腸桿菌（1株產IMP-1，2株產VIM-2），不產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌各1株。肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922各1株作為陰性對照。將40 mmol/L Tris-HCl溶液與0.9% NaCl溶液等體積混合，加入不同量的厄他培南粉劑，使其終濃度分別為0.05 g/L、0.1 g/L、0.25 g/ L及0.5 g/L。吸取不同濃度的厄他培南溶液500 μL分別至4個EP管中，用無菌槍頭挑取血平皿上的純菌落，配成4 麥氏單位的菌懸液，每管加入10.0 % SDS 0.5 μL。35℃孵育1 h后，各管取150 μL菌懸液，12 000 g離心2 min，吸取上清液0.7 μL點樣至Anchorchip 96靶板，晾干后覆蓋點樣3.3 g/L的HCCA基質0.7 μL，待靶板上液滴晾干后進行MALDI-TOF MS檢測。以相同操作步驟，再取孵育2 h和3 h后的上清液點樣。空白對照為同體系同濃度的厄他培南溶液。利用flexAnalysis 3.3軟件比對分析質譜圖，篩選出最適厄他培南濃度及孵育時間。

1.2.4 MALDI-TOF MS檢測批次試驗 應用MALDI-TOF MS分批次檢測CRE及碳青霉烯類敏感腸桿菌科細菌水解厄他培南能力，批次試驗中厄他培南溶液濃度及孵育時間均參照預試驗中最適條件。質譜儀主要參數設置：采用線性正離子模式，離子源電壓1為20 kV，離子源電壓2為18 kV，離子源透鏡電壓6 kV，脈沖離子引出時間為100 ns，檢測質量范圍0～1 000 Da，激光衰減器偏置20 %，激光衰減器范圍30 %，激光強度65 %～75 %。質量控制：使用HCCA基質 （190 Da的［M+H］+峰，380 Da的 ［2M+H］+）和厄他培南（497 Da 的［M+Na］+峰）進行定標。

2 結果

2.1 鑒定、藥敏試驗及改良Hodge試驗

復蘇菌株的MALDI-TOF MS鑒定結果與原鑒定結果一致。根據菌株的藥敏試驗結果，篩選出108株CRE，其中肺炎克雷伯菌75株，產氣腸桿菌17株，大腸埃希菌5株，陰溝腸桿菌5株，弗勞地枸櫞酸桿菌3株，產酸克雷伯菌2株，解鳥氨酸拉烏爾菌1株。對108株CRE菌株進行了改良Hodge試驗，結果顯示102株陽性。藥敏試驗及改良Hodge試驗結果見表1。

表1 117株腸桿菌科細菌的特征Table1 Characterization of 117 strains of Enterobacteriaceae bacteria

2.2 耐藥基因檢測結果

102株改良Hodge試驗陽性CRE均攜帶不同類型的碳青霉烯酶基因，其中blaKPC-290株、blaNDM-14株、blaVIM-23株、blaIMP-12株、blaIMP-42株、同時攜帶blaKPC-2和blaIMP-41株；6株改良Hodge試驗陰性CRE未檢出上述碳青霉烯酶基因。耐藥基因檢測結果見表1。

2.3 MALDI-TOF MS檢測結果

預試驗結果顯示，8株產碳青霉烯酶CRE的厄他培南水解試驗均為陽性，在35℃條件下孵育2 h后，厄他培南為0.1 g/L時的質譜峰明顯下降，其水解產物質譜峰明顯升高，在該條件下能夠快速準確地判斷水解結果；當厄他培南濃度為0.05 g/ L時，抗生素峰本身峰強度低，孵育后其質譜峰強度更低，難以被檢測；當厄他培南濃度為0.25 g/L或0.5 g/L時，孵育2 h后抗生素峰下降不顯著，需延長孵育時間至3～5 h，不利于快速得到結果。此外，2株不產碳青霉烯酶CRE、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922的厄他培南水解試驗均為陰性，孵育后厄他培南的質譜峰無明顯變化。預試驗中1株產KPC-2肺炎克雷伯菌在不同濃度厄他培南溶液中孵育2 h的質譜結果見圖1。

圖1 空白對照、陰性對照及1株產KPC-2肺炎克雷伯菌在厄他培南不同濃度下孵育2 h的質譜圖Figure 1 MALDI-TOF MS spectra of ertapenem solution at different concentrations for blank control， negative control and one KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strain in 2 hours

應用MALDI-TOF MS批量測試腸桿菌科細菌水解厄他培南能力，產碳青霉烯酶的CRE與厄他培南共同孵育2 h后，497 Da的［M+Na］+和519 Da的［M +2Na］+抗生素峰明顯下降，471 Da的［Mhydr/decarb+Na］+和537 Da的［Mhydr+2Na］+抗生素水解/脫羧產物峰明顯升高，而493 Da的［Mhydr+H］+和515 Da的［Mhydr+Na］+抗生素水解產物峰稍微升高。不產碳青霉烯酶的CRE與碳青霉烯類抗生素敏感的腸桿菌科細菌與陰性對照質譜峰一致。CRE在0.10 g/L濃度厄他培南孵育2 h后厄他培南的水解情況見圖1。

3 討論

腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制主要有：①產生碳青霉烯酶；②產超廣譜β內酰胺酶或頭孢菌素酶伴隨外膜蛋白缺失；③外排泵系統上調，其中產碳青霉烯酶是最重要的耐藥機制。目前用于檢測碳青霉烯酶的方法有：改良Hodge試驗、Carba NP試驗、分光光度法、PCR擴增及測序等。改良Hodge試驗操作簡單，但需要孵育過夜才能初步判斷產酶情況，檢測可能出現假陽性或假陰性［12］；Carba NP試驗需要特殊試劑裂解細菌抽提細菌總蛋白，檢測也可能存在假陰性［13］；分光光度法操作繁瑣，且檢測時間較長［14］；PCR方法檢測的特異度高，但該檢測方法對實驗室條件和技術要求較高［15］。

MALDI-TOF MS技術操作方法日臻成熟，它不但在鑒定臨床微生物中有廣泛應用，而且在細菌耐藥機制的研究中也有所突破［16-18］。有文獻報道，應用MALDI-TOF MS能快速檢測產碳青霉烯酶細菌［16，19］，其檢測原理為：細菌與抗生素共同孵育，細菌產生的碳青霉烯酶裂解碳青霉烯類抗生素的β內酰胺環和產生的抗生素水解產物可被MALDI-TOF MS檢測，從而篩選出產碳青霉烯酶的細菌。

本研究在大批量MALDI-TOF MS試驗前進行了預試驗，建立了適合本實驗室的厄他培南水解實驗方案，篩選出最適厄他培南濃度和孵育時間，與相關文獻報道一致［20］，可能有兩方面原因：①本研究中挑取過夜培養的細菌至40 mmol/L Tris-HCl和0.9% NaCl混合溶液，配成4個麥氏濁度的菌懸液；其他相關研究將細菌挑至0.45% NaCl溶液中，同樣配成4個麥氏濁度的菌懸液，兩試驗的菌液濃度一致。②產KPC-2、NDM-1、VIM-2、IMP-1或IMP-4型碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌對厄他培南的水解能力相近，在適宜的溶液環境中（如40 mmol/L Tris-HCl和0.9% NaCl混合溶液，或者0.45% NaCl溶液）均能快速水解厄他培南。本研究中觀察到質譜圖497 Da的［M +Na］+和519 Da的［M +2Na］+抗生素峰明顯下降，471 Da的［Mhydr/decarb+Na］+和537 Da的［Mhydr+2Na］+抗生素水解/脫羧產物峰明顯升高，表示細菌水解厄他培南。產碳青霉烯酶CRE與0.1 g/L厄他培南溶液共同孵育2 h后，產碳青霉烯酶CRE均水解厄他培南，其余腸桿菌科細菌不能水解厄他培南，因此，可以推斷出CRE水解厄他培南的能力與產碳青霉烯酶相關。

MALDI-TOF MS主要用于檢測大分子化合物，在檢測小分子抗生素時可能受到雜質干擾，由于十二烷基硫酸鈉 （SDS）不僅能有效抑制基質信號［21］，而且降低了Tris-HCl與NaCl緩沖液上清液中細菌蛋白豐度［22］，本研究加入適量SDS至緩沖液提高了檢測特異性。本實驗同時還采用了AnchorChip靶板，其表面疏水作用基團的中央具有親水基團，溶劑蒸發時樣品液滴收縮增加了抗生素豐度，相對常規靶板靈敏度提高1～2個數量級［23］，提高了檢測的敏感性。

相對于常規碳青霉烯酶檢測方法，MALDITOF MS法檢測產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌厄他培南的水解能力有諸多優點：①檢測速度快，2 h內即可得到細菌是否產碳青霉烯酶結果；②能夠檢測產不同類型碳青霉烯酶CRE水解厄他培南能力，包括KPC-2、 NDM-1、VIM-2、IMP-1和IMP-4等；③檢測的準確性高，攜帶碳青霉烯酶基因的CRE均水解厄他培南，與文獻報道相符［20，24］；④操作簡單，試劑用量少。但是該技術也存在局限性，僅能檢測產碳青霉烯酶細菌是否水解碳青霉烯類抗生素，能否檢測其他耐藥機制有待進一步研究。

本研究利用MALDI-TOF MS檢測產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌對厄他培南的水解能力，建立了適合本實驗室快速、經濟和高效的檢測方法，有利于快速篩查產碳青霉烯酶CRE，推斷其對碳青霉烯類抗生素的耐藥性，對指導臨床早期進行合理的抗生素治療，控制醫院內產碳青霉烯酶CRE傳播有重要意義。

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Application of MALDI-TOF mass spectrometry to determine the ertapenemhydrolyzing ability in carbapenemases-producing Enterobacteriaceae

LI Yuanrui， LIU Jingxian， YU Jing， CHEN Feng， LIU Ying.
（Department of Laboratory Medicine， Xinhua Hospital， Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

Objective To determine the ability of KPC-2， NDM-1， VIM-2， IMP-1 and IMP-4 producing Enterobacteriaceae to hydrolyze ertapenem using matrix assisted laser desorption ionization time of fight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） system. Methods Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE） isolates were collected from a variety of clinical specimens in Xinhua Hospital Affliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine， from June 2009 to December 2013. Modifed Hodge test was performed to screen phenotype of carbapenemase production， and carbapenemase genes were detected by PCR amplifcation with sequencing analysis. A MALDI-TOF MS-based assay was set up to investigate the ability of CRE to hydrolyze ertapenem under the optimal concentration of ertapenem and incubation time， which were determined in preliminary experiment. Results Of the 108 CRE isolates， 102 were positive for modifed Hodge test， including 90 strains producing KPC-2， 4 strains NDM-1， 3 strains VIM-2， 2 strains IMP-1， 2 strains IMP-4， 1 strains both KPC-2 and IMP-4 carbapenemase. All the carbapenemase-producing Enterobacteriaceae strains could hydrolyze ertapenem in 2 hours. Other 6 CRE strains were negative for modified Hodge test，in which carbapenemase gene were not detected and they did not hydrolyze ertapenem. Conclusions In clinical microbiology laboratory， MALDI-TOF MS is rapid and accurate for determining ertapenem-hydrolyzing ability， which is useful for screeningcarbapenemases-producing Enterobacteriaceae， and guiding rational carbapenems use at early stage of infection.

matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry； carbapenemasesproducing； Enterobacteriaceae； ertapenem； hydrolytic ability

R378.2

A

1009-7708 （ 2016） 05-0608-06

10.16718/j.1009-7708.2016.05.014

2015-08-26

2015-11-18

上海交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科臨床微生物室，上海 200092。

李媛睿（1990—），女，碩士研究生，主要從事微生物耐藥性檢測技術的應用研究。

劉瑛，E-mail：lywjw0129@163.com。