一氧化碳釋放分子- 2對小鼠廣泛耐藥鮑曼不動桿菌肺炎的療效觀察

秦 帥， 王曉麗， 潘婷婷， 譚若銘， 李梅玲， 李 磊， 瞿洪平， 黃 潔

·論著·

一氧化碳釋放分子- 2對小鼠廣泛耐藥鮑曼不動桿菌肺炎的療效觀察

秦 帥， 王曉麗， 潘婷婷， 譚若銘， 李梅玲， 李 磊， 瞿洪平， 黃 潔

目的 評價一氧化碳釋放分子-2（CORM-2）對小鼠廣泛耐藥鮑曼不動桿菌（XDRAB）肺炎的療效。方法 通過體外抑菌試驗檢測CORM-2對XDRAB生長的抑制作用。再通過建立XDRAB肺炎小鼠模型，觀察CORM-2對肺炎小鼠的抗菌、抗炎效果。結果 CORM-2顯著下調XDRAB肺炎小鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和抗炎因子IL-10的水平，抑制肺組織髓過氧化物酶（MPO）與一氧化氮（NO）的表達，減輕肺組織病理損傷，同時顯著降低了肺組織內細菌負荷量。結論 CORM-2在體外和體內對XDRAB均具有顯著的抑菌作用，同時在體內發揮重要的抗炎、抗氧化作用。

一氧化碳釋放分子； 鮑曼不動桿菌； 肺炎； 小鼠

鮑曼不動桿菌是一種常見的不發酵糖、氧化酶陰性的需氧革蘭陰性桿菌。近年來隨著其耐藥性的不斷增加，多重耐藥（MDR）、廣泛耐藥（XDR）甚至全耐藥（PDR）鮑曼不動桿菌在全球廣泛播散，成為醫院感染的主要病原菌之一［1-2］。2013年CHINET顯示鮑曼不動桿菌已成為國內第三大醫院感染病原菌［3］。而XDR鮑曼不動桿菌（XDRAB）是國內目前最主要的流行株，尤其在重癥監護病房（ICU）暴發流行［4］。針對XDRAB的抗菌藥物選擇與療效均非常有限，臨床上迫切需求新的有效的抗菌藥物研發。近年研究發現，外源性一氧化碳（CO）釋放分子（carbon monoxide-releasing molecule，CORM）對眾多常見病原菌都有良好的抗菌作用，甚至好于目前臨床常用的抗生素［5］。這對于細菌耐藥性不斷增加的現狀來說可能具有重要的意義。本研究旨在通過CORM-2治療XDRAB小鼠肺炎的結果驗證CO的抗炎與抗菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 小鼠肺炎造模用菌株采用本院外科

ICU（SICU）流行菌XDRAB，由臨床微生物檢驗科提供，經血平皿劃線鋪板孵育后挑單克隆菌株，鑒定后分管，-80℃冰箱保存。通過前期實驗，證實5×107CFU/20 μL的XDRAB可成功造模小鼠肺炎，且24 h存活率100 %，72 h后半數以上死亡，因此本實驗造模濃度確定為2.5×109CFU/mL。實驗前將菌株接種入LB培養液，37℃孵育18 h后計數并調整最終濃度至2.5×109CFU/mL。

1.1.2 主要試劑與儀器 CORM-2，分子式為

Ru （CO）4Cl2，購自Sigma-Aldrich （St Louis，MO，美國）公司，溶解在DMSO中獲得

10 mmol / L溶液。等濃度CORM-2溶液置于37℃

培養箱靜置18 h，釋放CO，最后通入一氧化氮（NO）去除殘余CO，配置成失活的抑制CORM-2

（iCORM-2），即釋放盡CO后殘留的金屬羥化物載體。血平皿、MH瓊脂購自法國生物梅里埃公司。細菌鑒定采用VITEK-AMS自動化微生物分析儀，GNI+鑒定卡和藥敏卡片均由法國生物梅里埃公司提供。酶聯免疫吸附法（ELISA）測定腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-10、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、髓過氧化物酶（MPO）和NO試劑盒購自上海森雄科技實業有限公司。

1.1.3 實驗動物 清潔級C57BL/6小鼠40只，雄性，6周齡，平均體質量（20±2）g，購自中國科學院動物研究所，由上海交通大學醫學院動物實驗室飼養。

1.2 方法

1.2.1 體外抑菌試驗 將培養好的XDRAB培養液通過分光光度計D600檢測稀釋至0.2，分入無菌離心管，每管5 mL細菌液，分為A、B、C三大組，A組包括對照組、CORM-2（10 μg/mL）組和iCORM-2（10 μg/mL）組各15管，B組包括對照組、CORM-2（30 μg/mL）組和iCORM-2（30 μg/ mL）組各15管，C組包括對照組、CORM-2（50 μg/ mL）組和iCORM-2（50 μg/mL）組各15管。配置后放入37℃震蕩箱孵育，分別在2 h、6 h和12 h每組取出5管測D值，最后通過平均D值制作生長曲線。

1.2.2 小鼠肺炎模型 實驗小鼠隨機分成4組：對照組（A組，n=10），XDRAB肺炎組（B組，n=10），XDRAB肺炎+CORM-2（10 μg/g）組（C組，n=10）以及XDRAB肺炎+iCORM-2（10 μg/ g）組（D組，n=10）。所有小鼠麻醉前稱重，水合氯醛腹腔麻醉后，取頭高腳低位，采用滴鼻法造模。用微量注射器給B、C、D組小鼠經鼻腔慢速滴注菌液20 μL，A組小鼠滴注生理鹽水20 μL，滴注后保持小鼠直立位10 min，同時給予緩慢左右轉動。20 min后A組、B組采用滴鼻法分別給予20 μL生理鹽水滴鼻，C組、D組小鼠分別給予CORM-2和iCORM-2 20 μL（10 μg/g）滴鼻。造模后小鼠在無菌實驗室正常飼養24 h。

1.2.3 標本采集與檢測 在造模24 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠。每組隨機抽取5只小鼠，解剖后直接左心室采血，4 ℃ 3 000 g高速離心15 min，取上層血清-80℃保存，待測。之后快速解剖小鼠肺臟，取右肺洗凈后，4%甲醛固定，石蠟包埋，病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，用顯微鏡觀察肺組織的炎性反應和病理改變。每組剩余5只小鼠，無菌操作解剖肺臟，右肺放入無菌研磨管，加入研磨珠和無菌磷酸緩沖液（PBS）2 mL進行研磨，4 ℃ 10 000 g高速離心5 min，取上清液500 μL-80℃保存，以備檢測。左肺放入無菌研磨管，加入研磨珠和無菌PBS 2 mL進行研磨，各取500 μL混懸液，PBS稀釋至4 mL，各取50 μL接種血平皿，37 ℃培養18 h，計數平皿菌落數。

2 結果

2.1 CORM-2的體外抑菌效果

圖1是通過D600測值獲得的體外細菌生長曲線，實驗顯示CORM-2對XDRAB生長具有明顯的抑制作用，10 μg/mL（圖1A）、30 μg/mL（圖1B）和50 μg/mL（圖1C）均能達到顯著效果（P ＜0.05），而同樣濃度的iCORM-2失去了抗菌活性，對XDRAB生長無任何影響。因此選擇CORM-2 10 μg/mL（即10 μg/g）作為后續體內實驗的治療濃度。

圖1 體外抑菌試驗Figure 1 Bacteriostatic test of carbon monoxide-releasing molecule in vitro

2.2 CORM-2對肺炎小鼠的作用

2.2.1 肺組織形態學改變 正常對照組（A組）小鼠肺組織肺泡結構清晰，肺泡間質無炎性細胞浸潤，無水腫充血（圖2A）；XDRAB肺炎組（B組）小鼠的肺組織充血明顯，肺泡間質有大量炎性細胞浸潤，肺泡壁增寬，結構有破壞，肺泡腔內可見出血和滲出（圖2B）；XDRAB肺炎經CORM-2干預后（C組）肺組織充血程度、肺泡間質炎性浸潤及肺泡腔內的出血和滲出明顯減輕，肺泡壁水腫程度減輕（圖2C）；另外，XDRAB肺炎加iCORM-2組（D組）小鼠肺部肺組織結構有破壞，肺泡間質炎性細胞和紅細胞浸潤與XDRAB肺炎組近似（圖2D）。

圖2 小鼠肺部病理圖片（HE染色 ×100）Figure 2 Pathological images of mouse lung tissues （HE stain ×100）

2.2.2 肺炎小鼠血清細胞因子水平 通過ELISA檢測發現，造模24 h后，XDRAB肺炎組（B組）小鼠的血清TNF-α、IL-6和HMGB1水平較對照組顯著升高（P ＜0.05），而IL-10也明顯升高（P ＜0.05）。CORM-2干預后，肺炎小鼠的TNF-α、IL-6、HMGB1和IL-10水平顯著降低，提示CORM-2可下調炎性反應。另外，iCORM-2干預對肺炎小鼠血清細胞因子水平無明顯影響（P＞0.05），各組測值顯著高于CORM-2干預組（P＜0.05）。提示iCORM-2對炎性反應物無抑制作用，如圖3 （A～D）所示。

2.2.3 肺炎小鼠肺組織MPO與NO水平 通過ELISA檢測發現，肺組織MPO與NO水平在肺炎組小鼠顯著高于對照組（P ＜0.05）；CORM-2干預后，肺炎小鼠肺組織MPO與NO水平顯著下降（P＜0.05）；iCORM-2干預對肺炎小鼠肺組織MPO與NO水平無明顯影響（P＞0.05），對比CORM-2干預組差異有統計學意義（P＜0.05），如圖3 （E～F）所示。

2.2.4 肺組織勻漿菌落計數 各組小鼠肺組織勻漿經稀釋320倍后鋪于血平皿培養18 h（圖4）。結果發現對照組無菌落生長，XDRAB肺炎+CORM-2組菌落生長數明顯少于XDRAB肺炎組和XDRAB肺炎+iCORM-2組（P＜0.05），XDRAB肺炎組與XDRAB肺炎+iCORM-2組的菌落生長數差異無統計學意義（P＞0.05）。各平皿菌落隨機挑選5個克隆檢測后證實為造模用菌株。

3 討論

CO曾被認為是一種對人體有害的氣體，會與氧氣競爭性結合血紅蛋白，使氧的轉運發生障礙，引起組織缺氧。事實上，哺乳動物幾乎所有的器官組織細胞都能產生和釋放內源性CO［6］。CORM是利用特殊的載體結合CO后使其能在固體狀態下長期保存，遇溶劑則分解釋放CO氣體。目前用于科研的主要有CO緩慢釋放型CORM-A1、過渡金屬載體化合物CORM-2和改進的過渡金屬載體化合物CORM-3。隨著研究的深入，學者們發現CO是繼NO之后又一個重要的氣體信號分子，具有抗氧化、抗炎與抗凋亡等細胞保護作用［7］。CORM-2在膿毒癥休克小鼠，可通過抑制細胞黏附分子-1（ICAM-1）與一氧化氮合酶（INOS）減輕小腸炎性反應和氧化應激［8］；CORM-3通過減少中性粒細胞表面彈性蛋白酶，抑制粒細胞在血管內皮表面的滾動與黏附，減少膿毒癥小鼠肺內粒細胞的聚集［9］；在小鼠移植氣管，CORM-2可降低血清干擾素（IFN）-γ、IL-2和IL-17A表達，減少移植氣管內CD3+淋巴細胞與巨噬細胞量，從而發揮抗氣管移植排斥的作用［10］；CORM-3抑制脂多糖（LPS）、INF-γ刺激小膠質細胞引起的炎性反應，其機制可能是通過抑制PI3K與細胞外調節蛋白激酶（ERK）［11］；CORM-2顯著抑制燒傷小鼠小腸炎性因子釋放［ IL-1β、TNF-α、丙二醛（MDA）和NO ］，減少燒傷引起的活性氧簇（ROS）生成，減少氧化應激［12］。本研究同樣發現，CORM-2可以顯著抑制XDRAB肺炎小鼠促炎因子的釋放，同時下調肺內MPO與NO水平，從而減輕了肺組織水腫、炎細胞浸潤和結構損傷。而失活的iCORM的無法達到以上效果，證明CO在抑制炎性反應和抗氧化反應中起著重要作用。

圖3 小鼠血清細胞因子和肺組織MPO、NO水平Figure 3 Levels of TNF-α， IL-6， HMGB1， IL-10 in serum， and myeloperoxidase， nitrogen monoxide levels in lung tissue

圖4 肺組織勻漿菌落計數Figure 4 Colony count in lung tissue homogenate

CORM的抗菌作用在近年才得到研究。NOBRE等［13］2007年報道了CORM對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌生長的抑制作用，首次發現了CO的殺菌作用；DESMARD等［14］也發現CORM-3可通過干擾呼吸鏈電子傳遞抑制銅綠假單胞菌生長，提高銅綠假單胞菌感染小鼠的存活率；MURRAY等［15］發現CORM-2可破壞銅綠假單胞菌生物被膜而起到殺菌效果；BANG等［16］發現CORM-2對產ESBL大腸埃希菌同樣具有殺菌效應。為進一步探討CORM-2對耐藥菌的作用，我們首先通過體外實驗證實了CORM-2對體外培養的XDRAB具有顯著的抑菌作用，而iCORM-2并不具備抗菌活性，間接證明CORM-2的抗菌效應以CO為主。在小鼠體內實驗中，我們同樣證實了CORM-2對XDRAB的抗菌效應，在減少肺內細菌負荷的同時緩解了肺部炎性反應，而iCORM-2在體內同樣不具有抗菌活性。

這些研究都證實了CO的抗菌特性，然而也有學者發現，CORM-A1可發揮抑菌作用而無殺菌效果，對抑制銅綠假單胞菌呼吸氧耗的作用顯著弱于CORM-2和CORM-3，同時CO釋放的快慢對其抗菌作用并無明顯影響［17-18］。同樣釋放CO，它們的殺菌效果為何存在差異？事實上，CORMA1與CORM-2、CORM-3最根本區別是不含過渡金屬載體（Ru）。NORBE等［19］通過基因芯片發現CORM-2作用于大腸埃希菌后引起硫代謝和蛋氨酸代謝相關蛋白上調。MCLEAN等［20］發現CORM-3治療時進入細胞的Ru濃度約是iCORM-3的2倍，CORM-3可引起細菌顯著的基因組學變化，抑制ABC轉運蛋白，影響硫代謝和下調細胞內自由硫基，而iCORM-3的作用微弱。這些研究提示，CO和Ru在抑菌、殺菌機制中發揮著重要的協同作用，CORM-2和CORM-3所含的Ru通過結合細胞內含硫氨基酸協助CO快速進入細胞內發揮抗菌作用，同時減少CO與血紅蛋白接觸機會而不產生毒性。

綜上所述，CORM-2對XDRAB具有顯著的殺菌作用，并且在XDRAB肺炎小鼠體內同時發揮抗炎和抗菌作用。這些都提示CORM有望成為研發新型抗菌藥物的基礎物質，甚至為耐藥菌的治療帶來希望。

［1］RICHET H， FOURNIER PE. Nosocomial infections caused by Acinetobacter baumannii： a major threat worldwide［J］. Infect Control Hosp Epidemiol， 2006， 27（7）：645-646.

［2］DIJKSHOORN L， NEMEC A， SEIFERT H. An increasing threat in hospitals： multidrug-resistant Acinetobacter baumannii［J］. Nat Rev Microbiol， 2007， 5（12）：939-951.

［3］胡付品， 朱德妹， 汪復，等. 2013年中國CHINET細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志， 2014， 14（5）：365-374.

［4］王莉， 周鳳萍. ICU多重耐藥鮑曼不動桿菌醫院感染暴發流行病學調查［J］. 中國感染控制雜志， 2013， 12（2）：113-116.

［5］ANTHONYSAMY A， BALASUBRAMANIAN S，SHANMUGAIAH V， et al. Synthesis， characterization and electrochemistry of 4'-functionalized 2，2'：6'，2''-terpyridine ruthenium（II） complexes and their biological activity［J］. Dalton Trans， 2008， 16（16）：2136-2143.

［6］COBURN RF. Endogenous carbon monoxide production［J］. N Engl J Med， 1970， 282（4）：207-209.

［7］CHEN P， SUN B， CHEN H， et al. Effects of carbon monoxide releasing molecule-liberated CO on severe acute pancreatitis in rats［J］. Cytokine， 2010， 49（1）：15-23.

［8］WANG X， CAO J， SUN BW， et al. Exogenous carbon monoxide attenuates inflammatory responses in the small intestine of septic mice［J］. World J Gastroenterol， 2012， 18（40）： 5719-5728.

［9］MIZUGUCHI S， STEPHEN J， BIHARI R， et al. CORM-3-derived CO modulates polymorphonuclear leukocyte migration across the vascular endothelium by reducing levels of cell surface-bound elastase［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009， 297（3）：H920-H929.

［10］OHTSUKA T， KASEDA K， SHIGENOBU T， et al. Carbon monoxide-releasing molecule attenuates allograft airway rejection［J］. Transpl Int， 2014， 27（7）：741-747.

［11］BANI-HANI MG， GREENSTEIN D， MANN BE， et al. A carbon monoxide-releasing molecule（ CORM-3） attenuates lipopolysaccharide- and interferon-gamma-induced inflammation in microglia［J］. Pharmacol Rep， 2006， 58Suppl：132-144.

［12］LIU DM， SUN BW， SUN ZW， et al. Suppression of inflammatory cytokine production and oxidative stress by CO-releasing molecules-liberated CO in the small intestine of thermally-injured mice［J］. Acta Pharmacol Sin， 2008， 29（7）：838-846.

［13］NOBRE LS， SEIXAS JD， ROM?O CC， et al. Antimicrobial action of carbon monoxide-releasing compounds［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2007， 51（12）： 4303-4307.

［14］DESMARD M， DAVIDGE KS， BOUVET O，et al. A carbon monoxide-releasing molecule（ CORM-3） exerts bactericidal activity against Pseudomonas aeruginosa and improves survival in an animal model of bacteraemia［J］. FASEB J， 2009， 23（4）：1023-1031.

［15］MURRAY TS， OKEGBE C， GAO Y， et al. The carbon monoxide releasing molecule CORM-2 attenuates Pseudomonas aeruginosa biofilm formation［J］.PLoS One， 2012， 7（4）：e35499.

［16］BANG CS， KRUSE R， DEMIRE I， et al. Multiresistant uropathogenic extended-spectrum β-lactamase（ ESBL）-producing Escherichia coli are susceptible to the carbon monoxide releasing molecule-2（ CORM-2） ［J］. Microb Pathog，2014， 66：29-35.

［17］WILSON JL， JESSE HE， HUGHES B， et al. Ru（CO）3Cl（Glycinate）（ CORM-3）： a carbon monoxide-releasing molecule with broad-spectrum antimicrobial and photosensitive activities against respiration and cation transport in Escherichia coli ［J］. Antioxid Redox Signal， 2013， 19（5）：497-509.

［18］DESMARD M， FORESTI R， MORIN D， et al. Differential antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa by carbon monoxide-releasing molecules［J］. Antioxid Redox Signal， 2012，16（2）：153-163.

［19］NOBRE LS， AL-SHAHROUR F， DOPAZO J， et al. Exploring the antimicrobial action of a carbon monoxide-releasing compound through whole-genome transcription profiling of Escherichia coli ［J］. Microbiology， 2009， 155（3）：813-824.

［20］MCLEAN S， BEGG R， JESSE HE， et al. Analysis of the bacterial response to Ru（CO）3Cl（Glycinate）（ CORM-3）and the inactivated compound identifies the role played by the ruthenium compound and reveals sulfur-containing species as a major target of CORM-3 action［J］. Antioxid Redox Signal，2013， 19（17）：1999-2012.

Effect of carbon monoxide-releasing molecule （CORM-2） in mouse model of pneumonia caused by extremely-drug resistant Acinetobacter baumannii

QIN Shuai， WANG Xiaoli， PAN Tingting， TAN Ruoming， LI Meiling， LI Lei， QU Hongping， HUANG Jie.
（Department of Intensive Care Unit， Ruijin Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200025， China）

Objective To evaluate the effcacy of carbon monoxide-releasing molecule （CORM-2） in mouse model of pneumonia caused by extremely-drug resistant Acinetobacter baumannii （XDRAB）. Methods To investigate the effect of CORM-2 on XDRAB proliferation in the bacteriostatic test in vitro. Then the mouse model of pneumonia was established by XDRAB challenge. The mice in experimental group were treated with CORM-2 by nasal insuffation. The anti-infammatory and bacteriostatic effects of CORM-2 were analyzed by comparing with the non-treatment group. Results Compared to the control group， CORM-2 treatment signifcantly down-regulated the infammatory factors of TNF-α， IL-6， HMGB1 and IL-10 in serum， inhibited the expressions of myeloperoxidase and nitrogen monoxide in lung tissues， alleviated pathological lung damage， and reduced bacterial load in lung tissues. Conclusions CORM-2 has signifcant bacteriostatic effect on XDRAB in vitro and in vivo. It also plays an important role in the anti-infammatory and antioxidant process in vivo.

carbon monoxide-releasing molecule； Acinetobacter baumannii； pneumonia； mouse

R378

A

1009-7708 （ 2016） 05-0583-06

10.16718/j.1009-7708.2016.05.010

2015-11-19

2015-12-29

上海市科委醫學引導項目（134119b0200）。

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院重癥醫學科，上海 200025。

秦帥（1976—），男，碩士，主治醫師，主要從事臨床危重病治療。

黃潔，E-mail： seaky_huang@yahoo.com。