基于G—四聯體門控制效應的鉛離子適配體傳感器

鄧歡 孫覓 魏小平 黎洪增 李建平

摘要將富鳥嘌呤（G）序列核酸適配體與門控制效應相結合，通過控制門的開關實現信號放大，構建了新型電化學生物傳感器，用于鉛離子（Pb2+）的高靈敏檢測。首先將單6巰基β環糊精（6SHβCD）自組裝在金電極上，形成有序排列的分子自組裝膜，且分子之間留有空隙，可作為探針通過的門結構。隨后將發夾結構的富含G序列的核酸適配體修飾在環糊精次面端口，制得可特異性識別Pb2+的電化學生物傳感器。富G序列適配體結合Pb2+后可折疊形成G四聯體結構（G4Pb2+），覆蓋住電極表面的探針通道，產生關門效應，使探針氧化還原電流強度減小，進而形成門控制效應，利用該效應可進行Pb2+的定量檢測。門控制效應顯著提高了信噪比和檢測的靈敏度，在1×10

Symbolm@@ 13 ～ 5×10 Symbolm@@ 11 mol/L濃度范圍內，Pb2+濃度的負對數與DPV響應電流呈良好的線性關系，檢出限為3.6×10

Symbolm@@ 14 mol/L（DL=3δb/K）。傳感器用于實際水樣品中Pb2+的測定，結果令人滿意。

關鍵詞 電化學傳感器； 門控制； G四聯體； 二價鉛離子

1引言

Pb2+是一種在生態系統中普遍存在的穩定、不可降解的污染物[1]，可在環境中長期積累，并對人體產生持續性影響。因此，檢測水環境中的Pb2+濃度顯得尤為重要[2]。近年來，發展了一些檢測Pb2+的方法，包括比色法[3]、熒光法[4]、原子吸收法[5]和伏安法[6]等。核酸適配體（Aptamer）是采用配體進化指數富集方法（SELEX），從隨機寡核苷酸文庫中篩選得到的一類能夠與靶分子特異性結合的人工合成的寡核苷酸序列，包括RNA、ssDNA 或dsDNA[7，8]。核酸適配體具有良好的穩定性和選擇性[3]，一些適配子可以特異性識別金屬離子。Li等[9]利用具有脫氧核酶（DNAzyme）活性的核酸適配體，結合氧化石墨烯，建立了比色檢測Pb2+的方法。此外，研究者們利用Pb2+與發夾型富含鳥嘌呤（G）的核酸適配體結合，使其折疊形成G四聯體的強特異性配位作用，構建了多種基于G4Pb2+結構的電化學傳感器 [6，10～13]以及熒光傳感器[14]，然而這些傳感器產生信號的效率低，靈敏度不高。

門控制效應[15] 通過利用待測物控制探針分子穿過修飾電極表面的空隙到達電極表面的數量，進而間接測定待測物濃度。門控制效應通過含量極低的待測物來控制門的閉合，從而引起高濃度探針氧化還原電流值的改變，可以提高信噪比，最終實現對檢測信號的放大。

β環糊精（βCD）是由7個葡萄糖單元首尾相連成環的大環類化合物，具有疏水性空腔結構。本研究將門控制效應和核酸適配體結合，制備基于G四聯體門控制效應的新型Pb2+適配體傳感器。將巰基β環糊精自組裝在金電極表面時，βCD分子間形成可以使鐵氰化鉀探針通過的空隙[16， 17]，構成了對探針氧化還原電流起控制作用的“門”。利用連接在βCD上的富G序列適配體特異性識別Pb2+離子并折疊生成G四聯體，覆蓋βCD分子間空隙并阻擋探針通過，形成門控制效應，使探針在電極上的氧化還原電流減小，通過測定差分脈沖伏安電流響應值實現了對Pb2+高靈敏的定量檢測。2實驗部分

2.1儀器與試劑

CHI660D電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；手提式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫用核子儀器有限公司）；ZHJHC2112B垂直流超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；KQ3200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GSP7703磁力磁力攪拌器（蘇北分析儀器廠）。

核酸適配體G4序列（5′TCATGGGTGGGTGGGTGGGTGANH23′，上海生工生物工程股份有限公司）； 6巰基β環糊精（6SHβCD， 山東濱州智源生物科技有限公司）；對甲基苯磺酰氯（PTSC，國藥集團化學試劑有限公司）；吡啶（C5H5N，廣東汕頭西隴化工廠）；氨基乙酸（C2H5NO2，國藥集團化學試劑有限公司）； HCl、N羥基琥珀酰亞胺 （NHS）、1乙基33二甲基氨丙基碳化二亞胺（EDC）、二甲基亞砜（DMSO）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、Pb（NO3）2等均為分析純；所用緩沖液為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）；實驗用水為超純水。

2.2核酸適配體溶液的配制

TrisHClEDTA（TE）緩沖溶液：配制1 mol/L TrisHCl緩沖液，取1 mL與0.2 mL的 0.5 mol/L ETDA溶液混合，用水定容至100 mL，得到TE緩沖液（pH 7.4）。

將TE緩沖液、玻璃棒、移液槍頭于120℃高溫高壓下滅菌20 min。冷卻后取出，同移液槍一起置于超凈工作臺上，于紫外燈下輻射30 min滅菌。將裝有適配體的離心管解凍，4800 r/min離心15 min。用移液槍移取適量的滅菌TE緩沖液，小心地注入離心管，搖勻，室溫下放置過夜使其完全溶解，于

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