復合免疫親和柱凈化—液相色譜—串聯質譜法測定動物源食品中6種黃曲霉毒素和6種玉米赤霉醇類真菌毒素殘留量

孫雪 郗存顯 唐柏彬 王國民 陳冬東 趙華

摘要 建立了動物源食品（豬肉、魚肉、豬肝）中6種黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2）和6種玉米赤霉醇類真菌毒素 （α玉米赤霉醇、β玉米赤霉醇、α玉米赤霉烯醇、β玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮）殘留量的復合免疫親和柱凈化高效液相色譜串聯質譜（HPLCMS/MS）檢測方法。樣品經β葡萄糖苷酸/硫酸酯復合酶酶解后， 用甲醇乙腈（20∶80， V/V）提取，提取液經玻璃纖維濾紙過濾，濾液用PBS溶液稀釋，復合免疫親和柱富集和凈化后，采用HPLCMS/MS法分析。12種目標分析物中AFB2和AFG2的線性范圍為0.03～6.0 μg/L，其余目標分析物的線性范圍為0.05～20 μg/L，線性相關系數均大于0.999，檢出限在0.01～0.03 μg/kg范圍內，定量限在0.04～0.09 μg/kg范圍內。分別以0.5， 1.0 和5.0 μg/kg添加濃度水平進行方法學驗證，平均回收率為73.6%～98.4%，相對標準偏差（RSD）為1.9%～11.2%。本方法簡便、靈敏，能夠滿足動物源食品中痕量黃曲霉毒素和玉米赤霉醇類真菌毒素殘留的測定要求。

關鍵詞 動物源食品； 復合免疫親和柱； 黃曲霉毒素； 玉米赤霉醇類真菌毒素； 高效液相色譜串聯質譜

1引言

真菌毒素來源于各種霉菌的次生代謝產物，包含多種化學結構不同的物質。常見的真菌毒素包括T2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素、嘔吐毒素等。玉米赤霉烯酮（ZON）是由鐮刀霉菌產生的一種雷索酸內酯類真菌毒素，在腸道和肝臟經3α和3β羥基類固醇脫氫酶（HSDs）羥基化，生成α玉米赤霉烯醇（αZOL）、β玉米赤霉烯醇（βZOL），之后進一步還原生成α玉米赤霉醇（αZAL）、β玉米赤霉醇（βZAL）和玉米赤霉酮（ZAN） [1，2 ]，這幾種物質與ZON合稱為玉米赤霉醇類真菌毒素（Zeranol， ZER）。黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是由曲霉菌代謝產生的一組致毒基團相同、化學結構類似的真菌毒素，常見的有黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）等，其中AFB1和AFB2可在機體內代謝產生黃曲霉毒素M1（AFM1）以及黃曲霉毒素M2（AFM2） [3 ]。

ZER及其代謝產物具有雌激素類物質的生物活性，能與雌激素受體相互作用， 產生一系列的毒副作用，包括生殖毒性 [4，5 ]、遺傳毒性 [6 ]、基因毒性 [7 ]、免疫毒性 [8 ]等，還可影響機體內分泌系統，導致內分泌紊亂，影響激素調節水平 [9，10 ]。AFs對人和動物的健康具有嚴重的威脅，其毒性包括DNA損傷和基因突變 [11 ]、致癌性 [12 ]、免疫毒性 [13 ]、生殖和生長毒性 [14 ]等，其中AFB1毒性比砒霜大68倍，致癌性是3，4苯并芘的4000倍 [15 ]，被國際癌癥研究機構歸為一類致癌物質。農業部2002年235號公告明確規定玉米赤霉醇在動物性食品中不得檢出 [16 ]；食品中黃曲霉毒素多以AFB1和AFM1的形式檢出，我國食品中AFB1的限量標準為0.5～20.0 μg/kg，AFM1的限量標準為0.5 μg/kg [17 ]。

動物被喂食真菌毒素污染的谷物及飼料后，組織（如牛羊肉、動物肝臟等）中可能會殘留真菌毒素，等通過食物鏈傳給食用者，對其健康構成潛在危害。因此建立高靈敏度、特異性、簡便、快速的毒素殘留分析方法非常必要。目前，有關ZER和AFs的測定方法有酶聯免疫分析法（ELISA） [18～20 ]、高效液相色譜法（HPLC） [21～23 ]、液相色譜質譜法（LCMS/MS） [24～26 ]等。ELISA具有較好的特異性及敏感性，且操作簡便、快速，但容易受到復雜基質的干擾，出現假陽性結果；HPLC雖無GCMS的化學衍生化過程，但其靈敏度低、定性準確度不高；而HPLCMS/MS可對多組分同時進行定性和定量分析，且具有專屬性強、選擇性好、靈敏度高等優勢，彌補了前述方法的不足，使得該技術在分析檢驗中得到了廣泛應用。

與傳統的液液萃取和固相萃取相比，免疫親和柱具有特異性好、凈化能力好、富集能力強等優點，本實驗室在前期研究中建立了免疫親和柱測定動物源食品中磺胺類藥物 [27 ]、玉米赤霉醇類真菌毒素 [21 ]殘留量的檢測方法，但由于動物源食品中常多種殘留獸藥，采用單一的免疫親和柱一次僅能測定其中的某種或者某類藥物的含量。為了滿足動物源食品中不同種類獸藥殘留的同時測定要求，本研究組進行了復合免疫親和柱在食品分析中的應用研究 [28 ]。在此基礎上，本研究建立了復合免疫親和柱凈化液相色譜串聯質譜法測定動物源食品中6種黃曲霉毒素和6種玉米赤霉醇類真菌毒素殘留量的方法，考察了復合免疫親和柱的性能，優化了樣品前處理方法。本方法的提取效率高，重現性好。相比本實驗室前期建立的玉米赤霉醇類真菌毒素殘留的檢測方法，本研究采用復合免疫親和柱，可同時對ZER和AFs兩類物質富集凈化；樣品采用混合溶劑一步提取，更加簡便、快速，檢出限和定量限更低，方法更加靈敏。本方法為動物源食品中ZER和AFs的同時檢測提供了重要參考。

3結果和討論

3.1樣品前處理條件的優化

3.1.1待凈化溶液中有機相的含量考察了待凈化溶液中有機相含量對IACAZ柱富集效果的影響。結果表明，當有機相含量≤20%時，ZER和AFs的回收率無明顯差別；當有機相含量>20%時，隨著有機相含量的增加，ZER和AFs的回收率明顯下降。因此，待凈化上載溶液中有機相的含量控制在20%以內。

3.1.2柱洗脫劑的選擇

取0.5 mL 1 μg/L混合標準溶液，用PBS稀釋至10 mL，上柱、淋洗后，分別用6 mL的甲醇、乙腈、無水乙醇作為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液進行分析。結果表明，5 mL水和5 mL PBS淋洗柱子， 能夠洗脫雜質且無目標分析物洗脫，當使用乙腈作為洗脫劑時，各目標待測物的洗脫率大于90%，故本實驗最終選定乙腈作為柱洗脫劑。隨著乙腈的用量增加，目標物的回收率隨之提高，當乙腈體積大于3 mL 時，回收率趨于穩定。因此，本方法采用3 mL乙腈作為柱洗脫液。

3.1.3提取溶劑的選擇玉米赤霉醇及其類似物為脂溶性物質，不溶于純水，溶于堿性水溶液和大多數有機溶劑，文獻報道的常用提取溶劑有乙醚、乙腈、叔丁基甲醚等 [21，29 ]。黃曲霉毒素類真菌毒素難溶于水，易溶于油及甲醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，文獻報道的常用提取溶劑為甲醇水或者乙腈水的混合溶劑 [30，31 ]，本實驗在樣品中添加5 μg/kg 目標物，比較了甲醇、乙腈、甲醇水、乙腈水、甲醇乙腈的提取效率（圖1）。結果表明，單一溶劑的提取效率都不理想，甲醇乙腈（20∶80， V/V）的提取效果較好，12種目標待測物的提取回收率均大于90%。

圖1不同溶劑對基質中ZER 和AFs 的提取回收率

Fig.1Extraction recoveries of ZER and AFs in matrices with different solvents

3.2基質效應的評價

本研究采用空白基質溶液和標準溶液分別配制相同濃度的基質效應曲線，基質效應ME（%）如下式[32]。

ME（%）=（K1/K2-1）×100%

其中K1和K2分別為基質匹配標準溶液所作曲線的斜率和無基質標準溶液所作曲線的斜率。對12種真菌毒素進行基質效應的評價，結果表明：豬肉中各分析物的基質效應值在

Symbolm@@ 4%～2%之間，魚肉中各分析物的基質效應值在

Symbolm@@ 12%～7%之間，肝臟中各分析物的基質效應在

Symbolm@@ 1%～13%之間，均在±15%以內，表明樣品經免疫親和柱凈化后沒有明顯的基質效應，可以用無基質標準溶液制作標準曲線，采用外標法定量。

3.3方法驗證

3.3.1線性方程、檢出限及定量限分別配制6種玉米赤霉醇類真菌毒素（0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0和20.0 μg/L）和6種黃曲霉毒素類真菌毒素（AFB1， AFG1， AFM1和AFM2為0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0和20.0 μg/L；AFB2和AFG2為0.03，0.15，0.3，1.5，3.0和6.0 μg/L）系列混合標準溶液。在最優條件下測定，以峰面積為縱坐標（y），標準溶液的質量濃度（μg/L） 為橫坐標（x），得到線性回歸方程，相關系數均大于0.999，表明各真菌毒素在其線性范圍內呈良好的線性關系（見表3）。采用標準添加法進行測定，以定量離子信噪比（S/N≥3）計算方法的檢出限為0.01～0.03 μg/kg；以信噪比（S/N≥10） 計算方法的定量限為0.04～0.09 μg/kg。

References

1Hildebrand A， Pfeiffer E， Metzler M. Toxicol lett.， 2010，192： 379-386

2Zinedine A， Soriano J M， Molto J C， Moltó J C， Maes J. Food Chem Toxicol.， 2007，45（1）： 1-18

3Bianco G， Russo R， Marzocco S， Velotto S， Autore G， Severino L. Toxicon.， 2012，59（6）： 644-650

4BO CunXiang， ZHANG ZhenLing， GUO QiMing， LIU YanZhong， LI Li， XIE Lin. Carcinogenesis， Teratogenesis & Mutagenesis.， 2006， 18（3）： 211-213

薄存香， 張振玲， 郭啟明， 劉衍忠， 李 莉， 謝 琳. 癌變， 畸變&突變， 2006， 18（3）： 211-213

5Zinedine A， Soriano J M， Molto J C. Food Chem Toxicol.， 2007， 45： 1-18

6Grosse Y， Chekir G L， Huc A. Cancer Lett.， 1997， 114： 225-229

7Minervini F， Lacalandra G M， Filannino A， Nicassio M E， Dell A. Theriogenology， 2010， 73（3）： 392-403

8AbidEssefi S， Baudrimont I， Hassen W， Ouanes Z， Mobio T A， Anane R， Creppy E E， Bacha H. Toxicology， 2003， 192： 237-248

9LIU Qing， WANG YaJun， XU Hui. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences， 2013， 4： 1147-1154

劉 青， 王亞軍， 徐 輝. 畜牧獸醫學報， 2013， 4： 1147-1154

10Marin D E， Taranu I， Daniela S， Tudor. Toxicon， 2010， 56： 956-963

11SHI YingHua， XU ZiRong， WANG ChengZhang. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering， 2004， 20： 293-300

史瑩華， 許梓榮， 王成章. 農業工程學報， 2004， 20： 293-300

12CHENYong， ZHANG HuiLing， ZHOU GuangHong. China Poultry， 2001， 23（9）： 35-36

陳 勇， 張慧玲， 周光宏. 中國家禽， 2001， 23（9）： 35-36

13Agag B. Ass. Univ. Bull Environ. Res.， 2004， 7： 176-206

14LIU ZhaoRen， GAO ShuYun， ZHAO SanQiang. Rural breeding technology， 2012， 9： 7-8

劉兆仁， 高樹云， 趙三強. 農村養殖技術， 2012， 9： 7-8

15TIAN WeiRong， DAI XingHong， HU Ping. Animal Husbandry and Feed Scinence， 2013， 34（2）： 36-38

田維榮， 代興紅， 胡 萍. 畜牧與飼料科學， 2013， 34（2）： 36-38

16MaximumResidues of Veterinary Drugs Limit in FoodProducing Animal. Ministry of Agriculture， No.235. Bulletin of the Ministry of Agriculture of the Peoples Repulbic of China

動物性食品中獸藥最高殘留限量， 中華人民共和國農業部第235號公告

17GB 27612011. Maximum Levels of Mycotoxins in Foods. National Standards of the People′s Republic of China

食品中真菌毒素限量， 中華人民共和國國家標準. GB 27612011

18Minervini F， Lacalandra G M， Filannino A. Theriogenology， 2010， 73： 392-403

19Haas D， Pfeifer B， Reiterich C， Partenheimer R， Reck B， Buzina W. Inter. J. Food Microbiol.， 2013， 166（2）： 316-322

20ZHOU Hao， WANG LiNa， LI JunXia， XIAO QuanWei， LIU Ying. China Feed， 2010， （9）： 40-44

周 浩， 王利娜， 李俊霞， 肖全偉， 劉 英. 中國飼料， 2010， （9）： 40-44

21YOU LiNa，LI XianLiang， ZHAO Hua. Chinese Journal of Chromatography， 2012， 30（10）： 1021-1025

游麗娜， 李賢良， 趙 華. 色譜， 2012， 30（10）： 1021-1025

22XIE Gang， WANG SongXue， ZHANG Yan. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（2）： 223-228

謝 剛， 王松雪， 張 艷. 分析化學， 2013， 41（2）： 223-228

23Lei B， Trucksess M W， White K D. J. AOAC Inter.， 2010， 93（3）： 936-942

24Delmulle B， De S S， Adams A， De Kimpe N， Van Peteghem C. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2006， 20（5）： 771-776

25PENG Tao， LI XiaoJuan， CHEN DongDong， TANG YingZhang. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（4）： 469-474

彭 濤， 李曉娟， 陳冬東， 唐英章. 分析化學， 2010， 38（4）： 469-474

26Zheng H， ZHENG Y L， LUAN L J， CAI Z X， REN Y P， WU Y J. Anal. Chim. Acta， 2010， 664 ： 165-171

27YUAN ZhongZhen， ZHANG Lei， ZHAO Hua. Journal of Instrumental Analysis， 2013， 32（3）： 478-482

袁中珍，張雷，趙華. 分析測試學報， 2013， 32（3）： 478-482

28WANG Qing， XI CunXian， TANG BaiBin， WANG GuoMin， CHEN DongDong， ZHAO Hua. Chinese Journal of Chromatography， 2014， （6）： 640-646

王 清， 郗存顯， 唐柏彬， 王國民， 陳冬東， 趙華. 色譜， 2014， （6）： 640-646

29QIAN ZhuoZhen， LIU ZhiYu， DENG WuJian， WEI BoJuan. South China Fisheries Science， 2011， 7（1）： 62-68

錢卓真， 劉智禹， 鄧武劍， 魏博娟. 南方水產科學， 2011， 7（1）： 62-68

30GB 174802008. Determination of Aflatoxin B1 in Animal Feeding StuffsEnzymeLinked Immunosorbent Assay. National Standards of the People′s Republic of China

飼料中黃曲霉素B1的測定酶聯免疫吸附法， 中華人民共和國國家標準. GB 174802008

31GB 5413.372010. National Food Safety Standar Determination of Aflatoxin M1 in Milk and Milk Products. National Standards of the People′s Republic of China

乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定， 中華人民共和國國家標準. GB 5413.372010

32LUO HuiTai， HUANG XiaoLan， WU HuiQin， ZHU ZhiXin， HUANG Fang， LIN XiaoShan. Journal of Instrumental Analysis， 2011， 30（12）： 1329-1337

羅輝泰， 黃曉蘭， 吳惠勤， 朱志鑫， 黃 芳， 林曉珊. 分析測試學報， 2011， 30（12）： 1329-1337

33GB 5009.24-2010. National Food Safety Standard Determination of Aflatoxins M1 and B1 in Foods. National Standards of the People′s Republic of China

食品中黃曲霉毒素 M1和 B1的測定， 中華人民共和國國家標準. GB 5009.24-2010