磷脂組學研究中的分析檢測技術

朱超??梁瓊麟 王義明 羅國安

摘要 磷脂是細胞膜的主要組分，有非常重要的生理功能，與人類健康、疾病密切相關。因此，有必要對生物體內磷脂化合物進行全面的分析，深入研究磷脂在疾病發生發展過程中的生物功能。磷脂組學是通過全面的定性與定量分析磷脂化合物解決現有生物學問題的研究模式。磷脂分析檢測技術是實現磷脂組學研究的關鍵，包括樣品前處理、分離、定性與定量分析和組學數據挖掘等。本文綜述了磷脂組學研究中的分析檢測技術，為發展快速、穩定、可靠、高靈敏、高分辨、高通量的磷脂檢測平臺技術提供參考。磷脂組學與其他組學的整合研究將促進生命分析化學的進一步發展。

關鍵詞 磷脂； 分析檢測技術； 磷脂組學； 綜述

1引言

磷脂是細胞膜的主要成分，是生物活性物質及信息分子前體的貯備物質，在細胞生長、細胞遷移、細胞信號轉導、細胞識別、細胞相互作用、細胞凋亡等方面都具有重要的生理功能 [1～9 ]。磷脂通過影響人體內分泌或神經系統起到調節人體代謝的作用，與肥胖、糖尿病、癌癥、阿爾茲海默病、心血管疾病等多種疾病密切相關，甚至被認為是某些疾病的潛在生物標志物 [10～16 ]。因此，有必要對生命體內的磷脂化合物進行準確、高效的檢測，深入研究磷脂的生物功能，探討其與疾病發生、發展的關系并發現其在疾病預防、診斷和治療過程中的生物作用。

磷脂組學是對生物系統中磷脂化合物進行全面的定性、定量，解決現有與磷脂及其代謝相關的生物學問題。其研究策略 （圖1） 采用代謝組學的研究模式：針對疾病發生、發展、診斷、治療，藥物安全性和療效評價等生物學問題制定解決方案，設計并實施實驗過程，對大量生物樣本的檢測數據進行多元統計分析，尋找有關的潛在生物標志物，并進行驗證和闡釋生物學意義。其中，最關鍵的就是要有可靠的數據來源。這些數據的獲取依賴于磷脂分析檢測技術。

圖1磷脂組學研究的一般策略

Fig.1Strategy for phospholipidomics

磷脂分析檢測技術包括樣本前處理、磷脂化合物分離 （輪廓譜的獲取）、定性與定量分析及組學數據挖掘和相關數據庫的建立。本文對磷脂分析檢測技術進行綜述，對磷脂組學的研究前景進行展望，為代謝組學研究發展新技術、新方法提供有價值的參考。

2磷脂的種類與結構

磷脂主要分為兩大類，一類是甘油磷脂，另一類是鞘磷脂。甘油磷脂分子由4部分構成：1個磷酸，1個甘油骨架，1個親水頭部R和1個疏水尾部 （圖2A）。親水頭部R是磷脂分子的極性端，可以是膽堿、乙醇胺、肌醇、絲氨酸、甘油，構成不同類的甘油磷脂化合物：磷脂酸 （PA）、溶血磷脂酸 （LPA）、磷脂酰膽堿 （PC）、溶血性磷脂酰膽堿 （LPC）、磷脂酰乙醇胺 （PE）、溶血性磷脂酰乙醇胺 （LPE）、磷脂酰肌醇 （PI）、溶血磷脂酰肌醇 （LPI）、磷脂酰絲氨酸 （PS）、溶血磷脂酰絲氨酸 （LPS）、磷脂酰甘油 （PG）、溶血磷脂酰甘油 （LPG）、雙磷脂酰甘油 （DPG）。疏水尾部是磷脂分子的非極性端，主要由一條或兩條含有不同碳數 （n=14～22） 和不同不飽和度的（n=0～6） 的脂肪酸鏈構成。甘油結構中C1位置常連結飽和脂肪酸鏈，C2位置則常連結不飽和脂肪酸鏈。鞘磷脂分子結構與甘油磷脂結構非常相似，

由4部分構成： 1個磷酸，1個親水頭部R′，

1個鞘氨醇和1個脂肪酸 （圖2B）。鞘磷脂的親水頭部R′可以是膽堿或乙醇胺，是分子極性端；疏水尾部則由1條不同碳數和不同不飽和度的脂肪酸鏈與1條鞘氨醇的烴基鏈構成。脂肪酸鏈碳數相同不飽和度相同的情況下雙鍵位置也有不同。基于以上不同，同類磷脂化合物中包括含多種不同脂肪酸鏈的分子，可鑒定的磷脂分子理論總數超過1000種。

磷脂分子屬于兩性分子。針對磷脂化合物的性質選擇提取、分離、檢測手段，獲取定性或定量信息進而篩查生物學問題相關的潛在標志物并建立數據庫，是磷脂組學研究中分析檢測技術應完成的任務。隨著儀器分析和計算科學的不斷發展，磷脂分析檢測技術正在進一步完善。通過整合多種方法構建新型磷脂檢測平臺技術將滿足磷脂組學研究對發展簡便、快捷、高精度、高分辨、高通量的系統分析方法的要求。

3磷脂分析檢測技術

3.1生物樣本的前處理

3.1.1磷脂的提取由于生物樣本具有多樣性，涉及磷脂分析的生物樣本主要有血漿或血清、組織樣本、細胞樣本等 [17 ]。從復雜生物樣本中提取兩性磷脂化合物，主要方法包括液液萃取、液固萃取、單一溶劑提取。

已經報道的磷脂或總脂的液液萃取方法有多種，如Folch法 [18，19，22 ]、Bligh and Dyer （BD） 法 [19，20 ]、Gerber法 [21 ]、Babcock法 [21 ]、WernerSchmid法 [21 ]和RoseGottlieb法 [22 ]。其中BD法被認為是磷脂化合物提取的“金標準”，即采用極性較小的氯仿 （或二氯乙烷） 和極性相對較強的甲醇作為提取溶劑，使樣本中不同極性的磷脂化合物更好的溶出。此方法被廣泛用于提取細胞、血漿、腦組織和肝組織樣品中的總脂 [23～25 ]。其它常用的磷脂提取的溶劑體系還有正己烷/異丙醇/丙酮 [26 ]。但是，液液萃取法所需樣本量大 （>100 μL），且耗時長，在萃取、超聲、純化過程中， 磷脂化合物會有一定程度的損失 [26 ]。

固相萃取 （SPE） 是磷脂分離和富集的另外一種有效手段，能夠去除樣本中的中性脂，更適合磷脂化合物的提取。SPE可實現與色譜、質譜或NMR技術的在線串聯 [27，28 ]。目前應用的固相萃取方法中常采用的吸附劑有C18和鍵合硅膠 [29 ]、Si [30 ]、TiO2/SiO2核殼顆粒 [31 ]、丙氨基硅膠鍵合相 [32 ]等。洗脫劑則以氯仿、甲醇、異丙醇、正己烷等為主。常用的緩沖鹽包括乙酸銨、甲酸銨等。Fauland等 [33 ]采用兩根硅膠柱與一根氨基鍵合硅膠柱組合，將PC， LPC， PE， PI， PA， CL， PG， PS， SM等通過4個洗脫片段進行分離。SPE法可以連續處理多個樣品，操作簡單、重復性好、提取回收率能夠滿足分析要求。

為獲得更好的提取效率，降低樣本用量，單一溶劑提取方法被眾多研究者所采用。Matyash等 [34 ]利用甲基叔丁基醚 （MTBE） 提取生物樣品中的脂類物質。MTBE有超強的選擇性，不溶物可以離心除去。利用甲醇 （MeOH） 能夠簡便快捷的提取血漿磷脂，得到較為理想的提取回收率，適于提取血漿中的大部分磷脂 [35 ]。我們在之前的研究中采用異丙醇 （IPA） 法取代MeOH法提取血漿磷脂。結果表明，IPA作為提取溶劑時，除溶血卵磷脂的提取效率低于MeOH法，其它各類磷脂的提取率均高于或相當于MeOH法 [36 ]。單一溶劑的提取方法省去了富集過程、降低了提取過程中的損失，而且樣本用量低 （<10 μL）。

3.1.2磷脂的衍生化磷脂的衍生化是通過結構修飾改變分子性質，從而改善HPLC、毛細管電泳 （CE）、氣相色譜 （GC） 等方法檢測磷脂的選擇性和靈敏度，實現磷脂化合物進行定性和定量 [37 ]。衍生化方法主要包括：直接衍生化、水解后衍生化和其他衍生化。對于含有氨基頭部的磷脂化合物一般采用直接衍生化，其紫外吸收強度和傅里葉變換響應都會增強，檢測限能達到pmol水平 [38 ]。Haddadian等 [39 ]用甲基β環糊精修飾的膠束電毛細管色譜檢測熒光染料3（2糠酰）喹啉3環己烯 （FQ） 標記的氨基磷脂分子，檢出限最低可以達到0.1 fg。對于大多數的磷脂化合物，特別是甘油磷脂，常采用的衍生化方法是水解后的衍生化。甘油磷脂水解后生成甘油二酯，其中的自由羥基可被酰化或酯化，適于光譜檢測。當采用氣相色譜 （GC） 檢測時，首先用過磷脂酶C進行水解，后選擇不同試劑，例如：特丁基二甲基硅烷 （TBDMS） [40 ]、三甲基硅烷 （TMS） [41 ]、五氟苯甲酰 （PFB） [42 ]、七氟丁酸酐 （HFB） [43 ]等進行衍生化，降低化合物極性，提高靈敏度。

3.2磷脂的分離

色譜是分離磷脂的主要手段。磷脂具有不揮發、易吸水、不耐高溫等特點，不同類磷脂分子結構類似，同類分子之間只有脂肪酸鏈的碳數和不飽和度的差別。分離時易出現色譜峰重疊、拖尾等問題。因此，獲得良好色譜分離必須選擇合適的分離方法和洗脫方式。用于磷脂分離的主要色譜方法有薄層色譜法 （TLC）、HPLC和GC。由于GC分離磷脂化合物需經過衍生化，其應用受到一定限制。本文主要介紹TLC和HPLC方法。

3.2.1薄層色譜（TLC）/高效薄層色譜（HPTLC）TLC是利用不同磷脂種類在薄層板上產生不同的比移值，從而達到分離的目的 [44 ]，適于不同類別磷脂的分離。薄層色譜的吸附劑是涂抹在玻璃板、塑料或鋁基片上的，主要有兩種：硅膠G和硅膠H，其中硅膠H的吸附性更強。洗脫劑常用氯仿甲醇水 （醋酸鹽緩沖液或氨水），具體實驗應根據吸附劑的使用情況調整洗脫劑的種類和比例 [45～47 ]。常用的顯色劑包括：Dittmerlester 鉬藍顯色劑、茚三酮試劑、碘蒸氣顯色、Vaskovsky試劑和Dragendorff 試劑等。TLC能夠實現不同種類磷脂化合物的分離，通過與標準品對照進行定性與定量分析。方法簡單、方便、直觀，但預處理繁瑣、耗時，且影響準確度，需較高的點樣技術。TLC或二維TLC（2DTLC）在HPLC出現之前是非常重要的磷脂分離方法，由于方便、快速，現在仍被廣泛用于磷脂的類別分離 [32，46，48，49 ]。目前，高效薄層色譜 （HPTLC） 和二維高效薄層色譜 （2DHPTLC） [50，51 ]方法應用較多。

3.2.2高效液相色譜（HPLC）良好的分離非常有利于復雜樣本的定性與定量分析。雖然TLC在磷脂類別分離方面存在一定優勢，但其并不適于同類別內的不同磷脂分子的分離。借助HPLC系統可以實現磷脂化合物類別間和類別內的分離，為磷脂化合物定性提供了保留時間信息，也有利于磷脂的定量分析。用于磷脂分離的主要色譜方法包括反相高效液相色譜 （RPLC）、正相高效液相色譜 （NPLC） 和親水色譜 （HILIC），且可以串聯不同的檢測器，如紫外 （UV）、蒸發光散射 （ELSD） [52 ]和質譜 （MS）。

RPLC法能夠實現同一類磷脂化合物中不同分子的分離，但各類別間的分離效果較差，極性較強的脂先被洗脫出來 [24，52～54 ]。NPLC法能夠實現較好的類別間的分離，極性較弱的脂先被洗脫出來 [23，55，56 ]。由于NPLC方法常采用弱極性溶劑作為流動相，與極性相對較強溶液混合易產生氣泡，保留時間的飄移不可避免。HILIC法則使用RPLC法的流動相系統，其洗脫順序卻與NPLC法相同，克服了NPLC法保留時間飄移的缺陷，重現性良好 [29，57，58 ]。磷脂化合物的極性差別會影響分離度，因此，在洗脫方式上，梯度洗脫比等度洗脫更有利于磷脂分離，會獲得更好的峰形和分離度。磷脂化合物的HPLC分離方法總結見表1。

基于各類型色譜的優缺點，二維液相色譜方法（如2DNPLCRPLC [59，60 ]、2DHILICRPLC [61～63 ]）能夠同時獲得良好的類別間和類別內分離，被廣泛應用于磷脂組學的研究，其缺陷在于單次運行的時間比較長，分析通量小。因此，建立快速二維分離方法對于磷脂分析檢測技術發展和磷脂組學研究有很好的促進作用。

3.3磷脂的定性與定量分析

磷脂組學的研究目標是研究磷脂的生物功能，尋找磷脂及其代謝與疾病發生發展的關系。前提是對復雜生物體系內的磷脂化合物進行定性與定量分析。要確定磷脂化合物的類別歸屬 （確定分子的極性頭部和骨架）、分子結構 （脂肪酸鏈的碳數、雙鍵數和雙鍵位置）、生物樣本中的含量，從而深入研究其代謝途徑和代謝差異。由于磷脂分子結構的多樣性和相似性，對磷脂化合物進行全面的定性與定量分析是很大的挑戰。常用方法有光譜法、質譜或色譜質譜聯用法、核磁共振法等 （表2）。

3.3.1光譜

光譜主要利用磷脂化合物的特征吸收對磷脂進行定性與定量分析。通過最大吸收波長下的紫外吸收峰與磷脂標準溶液濃度的關系建立回歸方程，計算得到總磷脂或某類磷脂的含量。該方法只需排除非磷脂干擾，不需經過分離就可直接測定，操作簡單、線性良好、回收率高、精確度高。紫外檢測器是HPLC測定磷脂化合物常用的檢測器 [64 ]。磷脂化合物經過分離后，根據色譜峰的保留時間定性，根據峰面積積分值定量分析，但必須要有對應的同類磷脂的標準品。

利用傅里葉變換紅外光譜 （FTIR） 中提供的由于CO， PO2，POC振動吸收在1200～970 nm產生的譜帶信息進行定性與定量分析。 通過建立磷脂峰面積與濃度的回歸方程，計算出磷脂含量 [65 ]。該方法準確度高、重復性良好、操作簡便、分析速度快。

3.3.2質譜（MS）磷脂化合物的定性不僅要明確化合物的類別歸屬，更要明確分子組成。色譜分離可以提供用于判定類別歸屬的保留時間還可以抵消質譜中部分離子抑制。質譜提供磷脂分子的質量信息、離子碎片或中性丟失信息，從而進一步確定可能的分子結構。磷脂檢測中常用的質譜檢測器包括：離子阱質譜 （IT） [23 ]、飛行時間質譜 （TOF） [23 ]、四級桿飛行時間質譜（QTOF） [66 ]、傅里葉轉換質譜 （FT） [24 ]、軌道阱質譜 （Orbitrap） [67 ]等。IT和QTOF可以提供多級碎片信息；TOF， QTOF， FT， Orbitrap具有較高的分辨率，可以提供精確分子質量。高分辨質譜在鑒定m/z接近而元素組成不一致的基團時優勢明顯。采用色譜質譜聯用技術就可以根據保留時間、精確分子量和碎片離子信息對磷脂化合物進行結構鑒定 [67～70 ]，根據多級質譜信息確定相同分子量含有不同脂肪酸鏈的磷脂結構。然而，磷脂分子中不飽和脂肪酸鏈CC雙鍵位置的確定仍是難點。

質譜檢測的離子信號強度（在一定范圍內）均與離子數量大致線性相關。通過建立峰面積 （或待測物峰面積與內標物比值） 和標準品溶液濃度的標準曲線，由回歸方程計算得到未知樣本的含量 [23，24，29 ]。由于磷脂標準品種類受限，每類或離子化行為一致的多類磷脂可共用一種標準品進行定量分析。

3.3.3核磁共振譜（NMR）核磁共振技術是最通用的復雜生物樣本的分析手段，利用磷原子31P的核磁共振效應對磷脂化合物進行定性和定量分析。不同類別的磷脂由于化學環境不同，31P的化學位移也不同，通過監測31P的化學位移來鑒定磷脂的分子結構，其含量則由核磁響應信號的積分確定 [71 ]。借助1D NMR和2DNMR可以確定磷脂分子脂肪酸鏈中雙鍵的位置 [72～76 ]。NMR可與HPLC、MS、SPE等手段整合運用，獲取更有價值的結構信息，實現已知和未知磷脂化合物分子的結構鑒定，特別是分子中不飽和脂肪酸鏈的結構確認 [75，76 ]。NMR具有快速、準確性較高、深入物質內部而不破壞被測物質等優點 [77 ]。因此，核磁共振技術為磷脂化合物的結構鑒定提供了強有力的工具。然而，樣本用量大限制了NMR在生物樣本分析中的應用。此外，近年發展的高分辨魔角旋轉核磁共振技術 （HRMAS） 能夠消除非均相溶液中磁化率不同引起的譜線加寬，可以直接用于完整組織和器官中磷脂化合物的檢測，靈敏度較高 [78 ]。

發展新型平臺技術，必須綜合考慮各種分析檢測技術的特點，整合多種技術和數據庫，才能確定磷脂分子的類別、脂肪酸鏈的碳原子數、不飽和度及雙鍵位置、生物樣本中的含量及相關代謝途徑。整合色譜分離技術、高分辨質譜技術及核磁共振技術建立新型磷脂檢測平臺技術最能滿足磷脂化合物結構鑒定面臨的挑戰。

3.4組學數據挖掘

3.4.1數據處理方法磷脂組學完全借鑒代謝組學的數據處理方法。對充分挖掘化合物的大量的、多維的信息，進行一系列化學計量學方法計算，從中獲取具有生物學意義的潛在信息。首先需要對獲得的代謝物的輪廓譜數據進行歸一化和濾噪，消除多余的干擾因素，保留與分類有關的信息。正交信號校正技術 （OSC） 是最為廣泛應用的濾噪技術之一 [79 ]。生物標志物的發掘是通過對檢測到的所有化合物信息進行判別分析，找出對分類貢獻最大的一種或若干種變量 [80～82 ]。用于組學研究的聚類算法主要包括：非監督學習方法和監督學習方法。

非監督的學習方法是以原始圖譜或預處理后的圖譜數據對樣本進行歸類，不需任何樣本分類的背景信息。這種方法沒有訓練樣本可供學習利用，而是對給定的數據集進行模式判別和相關性分析。主要有主成分分析 （PCA）、K均值聚類、高斯模型等 [83～87 ]。

監督的學習方法適于分析有先驗知識和假設的數據。依據先驗知識對未知數據進行辨識、歸類、預測。這種方法需要建立測試模型判別性能的測試集和確認類別歸屬的確認集。代表方法有偏最小二乘法 （PLS）、非線性偏最小二乘法（OPLS）、偏最小二乘判別分析 （PLSDA）、非線性偏最小二乘判別分析 （OPLSDA）、人工神經網絡 （ANN） 等 [85，88 ]。

3.4.2數據庫數據庫是組學研究不可或缺的工具。數據庫除能夠提供生物體中各種代謝物的結構信息外，還應包涵化合物生化信息、疾病相關的代謝差異以及有關的定量數據。磷脂組學需要建立的數據庫是關于生物系統中所有磷脂化合物的數據庫，為未知磷脂化合物及其代謝物的結構鑒定提供相關信息或可用于已知磷脂分子生物功能的解釋。從數據庫或基于網絡的搜索引擎中獲取磷脂化合物的性質、分類、實驗技術、代謝途徑等相關信息。常用數據庫和搜索引擎包括：LIPIDAT （http：//www.lipidat.chemistry.ohiostate.edu）、Lipid Map （http：//www.lipidmaps.org/）、Cyberlipids （http：//www.cyberlipid.org/）、Lipid Library （http：//lipidlibrary.aocs.org/）、LIPIDAT （http：//www.lipidat.chemistry.ohiostate.edu）、Human Metabolome （HMBD， http：//www.hmdb.ca/）、LIPID Bank （www.lipidbank.jp）、KEGG （http：//www.kegg.jp/）、LIPIDMonster DB （http：//www.lipidmaps.org/tools/）、Lipidhome （http：//www.ebi.ac.uk/metabolights/lipidhome/）、代謝途徑數據庫 （http：//pid.nci.nih.gov/）、Pubmed數據資源 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）、代謝途徑數據庫 （http：//pid.nci.nih.gov/）、生物信息學數據庫 （ExPASy， http：//www.expasy.org/）、LipidSearchTM Software （Thermo scientific）、VaLID [89～91 ]。已經建立的脂質組學的數據庫為磷脂組學研究提供了大量化合物的結構信息、質譜信息和代謝途徑信息，為潛在生物標志物的鑒定提供參考 [92 ]。

4結語與展望

磷脂分析檢測技術是磷脂組學研究獲取穩定、可靠數據的必要手段，是順利實施實驗方案的重要保障。分析儀器和計算技術的不斷革新決定了磷脂檢測技術的發展趨勢。樣本前處理方法的發展趨勢：（1）樣品用量少降低樣本用量，特別是寶貴的臨床樣本的用量。（2）提取效率高 提高低豐度磷脂化合物的提取效率。（3）在線提取實現與LC、MS或NMR等的在線聯用，提高方法的簡捷程度和自動化程度。磷脂檢測技術將向著快速、穩定、重現性好、高靈敏度、高分辨率、高通量的方向發展 [66 ]，滿足微量和痕量磷脂化合物定性和定量分析要求。通過建立二維或多維色譜和質譜方法實現同類磷脂化合物不同分子的鑒定 [63，93 ]。完善磷脂組學的數據庫建設，使其能夠提供盡可能多的磷脂化合物及其代謝物相關的代謝通路信息，及與疾病相關的代謝差異的生物學意義的解釋。

采用單一技術是很難實現磷脂化合物的全面的定性和定量，必須針對生物樣本的特性，整合不同檢測技術的優勢，構建包含提取、分離、檢測、數據處理等的定性定量平臺技術，結合數據庫和相關軟件挖掘潛在標志物的各類信息。整合基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學等的數據信息，使相關數據庫和軟件的功能越來越強大，逐漸實現磷脂化合物鑒定和相關代謝途徑分析的自動化、網絡化、可視化。

磷脂組學研究是針對磷脂的代謝組學研究模式。隨著代謝組學的整合化發展 [17 ]，磷脂組學可以借助代謝組學提供的數據分析方法、脂質研究的數據庫和相關專家系統。與基因組學、轉錄組學 [94 ]、蛋白組學、代謝組學等進行多組學整合研究，從基因、蛋白、代謝等多層次研究磷脂化合物，尋找與疾病診斷、預防、治療相關的潛在生物標志物體系及相關的的代謝途徑、代謝規律和代謝網絡， 為人類健康提供更可靠、更有意義的數據。

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