高效液相色譜法測定澳洲堅果青皮中的4種酚類物質

劉秋月 葉麗君 黃文燁 黃雪松

摘 要 為開發利用澳洲堅果青皮，采用高效液相色譜法（HPLC）研究其對羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的測定方法和含量。結果表明，澳洲堅果青皮中，4種多酚的最佳測定條件為：以1% 乙酸水溶液和甲醇為流動相進行梯度洗脫（0 min，87% A；5 min，85% A；25～30 min，60% A），檢測波長260 nm，流速0.8 mL/min。并測得青皮中對羥基苯甲醇、3， 4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的含量分別為（1.3±0.12）、（0.19±0.001）、（0.046±0.003）、（0.15±0.00 9）mg/g。該方法簡單、高效、實用。

關鍵詞 澳洲堅果 ；對羥基苯甲醇 ；3，4-二羥基苯甲酸 ；對羥基苯甲醛 ；對羥基苯甲酸 ；青皮

中圖分類號 S664.9 ；TQ245.6 文獻標志碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.021

澳洲堅果（Macadamia ternifolia F. Muell）又名昆士蘭果、昆士蘭栗、澳洲胡桃、夏威夷果等[1]，因其果仁風味獨特、營養豐富而被譽為“干果皇后”。隨著我國農業產業結構的調整，我國澳洲堅果近年來獲得空前發展，種植面積已近4萬hm2[2]，年產干果近萬噸，除果仁直接食用、少量果殼（種皮）制作木炭外[3-5]，其綠色的果皮（俗稱青皮，占整果鮮重的45%～60%）僅有極少量用作漚肥或飼料，絕大部分被丟棄，亟需開發利用。

研究表明，澳洲堅果果仁中含有酚類酸、維生素E、甾醇等抗氧化活性成分[6-9]；蘆燕玲等[10]用萃取和氣相色譜-質譜聯用法分離鑒定出澳洲堅果殼中含有酸類；張明楷等[11]對6種澳洲堅果青皮中的單寧含量進行了測定。根據植物化學成分分析，澳洲堅果皮中應含有大量多酚類物質，需要首先研究其化學成分，以便有針對性地開發利用。施蕊等[12]報道澳洲堅果青皮中含有熊果苷、豆腐果苷等化學成分，但這不足以解釋其具有殺菌、抗氧化等多種生物活性。本研究課題組從澳洲堅果青皮中分離得到晶體狀態的3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲醇4種酚類化合物（鑒定結果將另文發表），這4種酚類物質都有一定抗氧化或殺菌的作用，即它們可以部分地解釋澳洲堅果青皮具有防腐殺菌和抗氧化[13]等功能與活性。

本研究旨在建立一種快速、準確測定澳洲堅果青皮中4種酚類物質的HPLC分析方法，以為該資源的進一步開發、利用、產品的質量控制等提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

澳洲堅果果實，由廣西南亞熱帶農業科學研究所王文林老師課題組饋贈。

1.1.2 主要儀器及試劑

本研究使用的主要儀器：Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀及配套SPD-M20A光電二極管陣列檢測器（DAD）（日本島津公司）；3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛標準品（AR級，阿拉丁試劑有限公司）；冰乙酸（AR級，天津化學試劑一廠）；甲醇（HPLC級，歐普森試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取自然干燥的澳洲堅果青皮磨成粉末，用70%的乙醇提取3次，合并提取液，50℃下旋轉蒸發除去溶劑，乙醇定容至50 mL，過0.45 μm濾膜，待測。

1.2.2 色譜條件的優化

通過掃描得到流動相和各單體酚類物質在紫外光區的最大吸收波長，選擇能同時測定以上4種酚類物質、又能避開溶劑吸收的適宜波長。流動相、流速、洗脫方式等都會對目標物質能否單獨出峰不受其它雜質干擾造成影響，進而影響樣品與標準品的對比，無法進行定性測定。通過調整流動相體系、梯度洗脫比例和流速、改變進樣量等獲得快速分離測定目標物質的最優條件。

1.2.3 標準曲線的繪制

精確稱取標準品3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛，對羥基苯甲醇100 mg，分別用甲醇定容至10 mL，得到每個標準品的單標儲備液。

分別移取50、100、150、200、250 μL 3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的標準溶液，20、30、40、50、60 μL對羥基苯甲酸標準溶液和4、6、8、10、12 μL對羥基苯甲醇標準溶液，用甲醇定容至50 mL，得到不同梯度的酚類混合標準溶液，每個濃度重復進樣6次，以各單體酚的平均峰面積（y）與標準溶液中物質的濃度（x）做校準曲線，計算標準曲線回歸方程及相關系數。

1.2.4 檢測限和定量限

將一定濃度的標準溶液逐級稀釋，進樣，當信噪比等于3時，所對應的標準溶液中所含組分的量為最低檢測限；當信噪比等于10時，所對應的標準溶液中所含組分的量為定量限。

1.2.5 加標回收測定

已知酚類物質含量的青皮提取液中，定量添加各酚類物質標準品，平行制備6份，并精確吸取10 μL進樣，計算各酚類物質的加標回收率。

1.2.6 重復性和儀器精密度測定

按上述方法重復制備6份樣品進樣，記錄峰面積，計算峰面積相對標準偏差（RSD），檢測方法的重復性。 同一樣品分3 d進行實驗，每天精確進樣10 μL，連續進樣6次，記錄峰面積，分別計算日內和日間峰面積RSD值，比較日內和日間儀器的精密度。

1.2.7 樣品穩定性測定

取同一樣品室溫下放置，并于樣品制備后的0、2、4、8、12、16、24、36、48 h進樣，每次進樣10 μL，測定峰面積，計算RSD值。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

對4種酚類標準品進行全波長掃描，得到其在紫外光區的吸收圖譜（圖1），由此得到各單體酚類物質的最大吸收波長（表1），為了能同時測定這幾種物質又能減少溶劑的影響，最終確定檢測波長為260 nm。

2.1.2 流動相的選擇

分別嘗試用1%乙酸水溶液-乙腈和1%乙酸水溶液-甲醇作流動相，當流動相含有乙腈時，即使含量較少，出峰時間也比較早，且4種酚類物質峰分離效果不佳；當流動相含有甲醇，且含量較低時，峰形則大大改善（圖2），故改用甲醇和1%乙酸水溶液作為流動相。

2.1.3 流速的選擇

實驗采用0.5、0.8、1.0 mL/min 3個流速，見圖3。結果發現，流速為0.5 mL/min時，分離效果好，但耗時較長；流速為1 mL/min時，用時短，但前2個峰出峰時間十分接近且最后的對羥基苯甲醛有肩峰，分離效果不佳；流速為0.8 mL/min時，可以在30 min內把4種酚類物質較好地分開。

2.1.4 色譜條件的最終確定

根據以上實驗，確定了澳洲堅果青皮4種酚類物質的HPLC測定條件，進樣量為10 μL，柱溫箱為40℃，且為了縮短檢測時間，采用濃度梯度洗脫，逐漸加大甲醇含量，以達到良好的分離效果，其梯度洗脫程序見表2。在此條件下得到了4中多酚混合標準溶液的液相色譜圖和樣品溶液的液相色譜圖（圖4）。

從圖4-B可以看出，對羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛4種物質均可以在相應的標樣圖4-A上予以確認（即據保留時間相同的原則予以定性鑒定）；另外，我們還比較了它們的紫外可見光譜也是一致的，這與原有鑒定結果一致（資料未發表）。因此，用該方法定性測定澳洲堅果青皮中的上述4種酚類物質是可行的。

2.2 標準曲線和檢測限

按上述色譜條件測得4條標準曲線，r值均高于0.99，所以得到的線性方程能滿足實驗條件，其線性方程、檢測限等見表3。

2.3 加標回收率

加標回收率測定結果見表4，結果顯示，4種酚類物質的回收率在99%～102%。

2.4 重復性

按上述方法對樣品6次進樣，計算對羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的峰面積RSD值分別為0.6%、0.1%、1.5%、0.4%，表明該方法重復性良好。

2.5 精密度

根據實驗結果，計算第一天對羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的峰面積RSD分別為：1.7%、0.7%、2.4%、0.3%；第二天各種組分的峰面積RSD分別為：2.2%、1.2%、2.0%、0.3%；第三天各種組分的峰面積RSD分別為：1.9%、0.3%、1.8%、0.3%。均小于3%，表明日內儀器精密度良好；日間比較各組分的峰面積RSD為：1.8%、1.0%、2%、0.4%，表明儀器的日間精密度良好。

2.6 穩定性

不同時間進樣，測定峰面積，計算對羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的峰面積RSD值分別為1.9%、1.0%、3.3%、1.0%，表明供試樣品在48 h內穩定性良好。

2.7 樣品的測定

按上述方法制備樣品并進行色譜分析，測定3次取平均值，測得干燥的澳洲堅果青皮中對羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的含量分別為（1.3±0.12）、（0.19±0.001）、（0.046±0.003）、（0.15±0.009）mg/g。

3 討論與結論

3.1 討論

酚類化合物的研究對澳洲堅果青皮的開發利用、尤其是開發具有防腐殺菌、抗氧化功能保健食品、漱口水等具有重要意義，目前澳洲堅果青皮中的酚類物質還未見報道，本研究所鑒定的4種酚類物質在其它物質中也未見同時報道。

在樣品前處理簡單、雜質較多的情況下同時分離并檢測此4種酚類物質具有一定的難度。本研究采用保留時間和二極管陣列光譜圖相結合的方法進行定性、進而進行定量測定，建立了一種新的、同時測定上述4種酚類物質的高效液相色譜分析方法。

3.2 結論

研究結果表明，以1%乙酸水溶液-甲醇作為流動相進行梯度洗脫（0 min，87% A；5 min，85% A；25～30 min，60% A），30 min內各組分的色譜峰分離效果較好、色譜峰峰形好。實驗以對羥基苯甲醇、3，4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛標準品測得的標準曲線分別為y=4 024.22x-48 847（r=0.999 6）、y=54 654.4x-105 270（r=0.998 9）、y=54 654.4x-105 270（r=0.999 3）、y=66 922.4x-89 492.6（r=0.999 5）；且前述4種酚類的最低檢測線在0.04～0.9 μg/mL，加標回收率在99%～102%，樣品中含量分別為（1.3±0.12）、（0.19±0.001）、（0.046±0.003）、（0.15±0.009）mg/g。該方法前處理簡單，樣品穩定，重復性好，操作簡單快速，準確性高。

參考文獻

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