鋸葉棕體細胞胚胎發生及植株再生體系的建立

彭欣怡 程琴 黃秋偉 李慧敏 王麗萍

摘 要 從鋸葉棕成熟種子中成功實現體細胞胚胎發生和植株再生。成熟種子放在MS培養基上培養，加入0.15%活性炭，452 μmol/L 2，4-D和14.7 μmol/L N6-2iP，所有成熟合子胚培養5周后長出體胚簇，12周后，外植體轉移到2，4-D濃度減到90.4 μmol/L的MS培養基中進行體胚增殖，之后體胚轉移到含有0.9， 9 μmol/L TDZ或沒有生長調節劑的基本培養基中轉化成小植株。9 μmol/L TDZ對植株再生是無效的，然而，在0.9 μmol/L TDZ中作次培養有12%胚胎能長成完整植株，沒有生長調節劑中35%胚胎長出嫩枝，這些嫩枝轉移到含有22.2 μmol/L NAA的培養基中全部都會生根。picloram和2，4-D對鋸葉棕幼苗愈傷的誘導效果最佳，6-BA次之，對子葉來說，picloram和2，4-D對愈傷的誘導起不到任何作用，而對莖尖的誘導效果最好。

關鍵詞 離體培養 ；鋸葉棕 ；體細胞胚胎 ；愈傷誘導

中圖分類號 S792.91 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.011

鋸葉棕[Serenoa repens（bartram）small]，又名鋸棕葉或鋸棕櫚，學名“沙巴棕”，屬于棕櫚科灌木植物，主要生長在佛羅里達州以及南北美洲的氣候炎熱地區[1]。鋸葉棕是最理想的景觀植物，它是一種堅韌，低維護的綠色植物，其生長少受水分脅迫及植物病害和蟲害的影響[2]。其成熟的干燥果實可供藥用，近年來發現其提取物治療良性前列腺增生（BPH）和下尿路（LUTS）癥狀效果顯著，現已成為最有效的3種治療BPH植物藥物之一[3-4]。鋸葉棕作為草藥制劑價值連城，受歡迎程度也正在日益增長。

鋸葉棕通過傳統種子繁育存在一定的局限性[5]，自然萌發需4～6個月，幼苗生長緩慢，一般需要2～6年[6]，將種子繁育溫度提高到35℃，萌發時間縮短至約1個月[5]，然而，很少人清楚鋸葉棕在自然條件下的最佳生長和結果條件。

植物組織培養是植物快速繁育的重要技術手段，通過組織培養可以大規模繁育基因優良物種，進行種質資源保護，也可以進行遺傳轉化實驗。國內尚無鋸葉棕組織培養的報道。本研究的宗旨是為了發展鋸葉棕體外再生的組織培養體系，以期為快速繁育國內優良稀缺植物資源提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

廣西亞熱帶作物研究所與美國加州灣食品科技公司合作引種、試種生長10年的鋸葉棕種子[7]。

1.2 方法

1.2.1 外植體準備

將收獲放置在陰暗干燥環境下保存1年的種子，剝去果皮和種皮，在超凈臺上用無菌水洗1遍，再用0.1% 升汞搖晃消毒8 min，去掉消毒液，用無菌水沖洗3遍，每次5 min。將消毒好的種子用枝剪進行橫切和縱切，露出種子凝膠狀的胚乳和圓錐形的胚。1粒種子1個培養皿。

1.2.2 培養基及培養條件

用1.0 mol/L NaOH 將全部培養基pH值調節 為5.8，121℃高壓滅菌20 min。根據不同試驗在基礎培養基中添加不同種類和濃度的激素，26℃黑暗培養。鋸葉棕體胚再生培養基和愈傷組織誘導培養基見表1。

1.2.3 愈傷組織的誘導

選取已經萌發成苗的小植株的莖尖、根尖及側根、子葉等部位以及胚簇進行愈傷組織的誘導，并設置不同激素進行實驗，26℃暗培養40 d，觀察愈傷組織分化情況，比較愈傷組織誘導的結果，以確定根系外植體的最佳部位。

2 結果與分析

2.1 體細胞胚胎發生與植株再生

機械破損處理能大幅度提高鋸葉棕發芽率，發芽率可達到90%，機械破損處理是鋸葉棕最有效的促芽方式[11]，用枝剪進行橫切和縱切，露出種胚以提高種子的萌發率。將處理好的種子每6周轉接一次新鮮MS1培養基（圖1a）。12周后，外植體轉移到2，4-D濃度減到90.4 μmol/L的MS2培養基中增殖，每個原始合子胚增殖為大約200個體細胞胚胎（圖1b），在35周內，增殖會繼續，但在此培養基上培養不能再維持。

將體細胞胚胎分別轉移到TDZ濃度為0，0.9和9 μmol/L 的MS3培養基中進行誘導培養，培養條件為25℃，光照16 h/d（圖1c）。每個處理用100個體細胞胚胎實驗，在TDZ為0的培養條件下，35%的胚胎長出嫩芽，但不長根；在0.9 μmol/L TDZ的培養中有12%的胚胎產生芽與初級根（圖1d），在含有9 μmol/L TDZ培養基中既不出芽也不生根。沒有生長調節劑和含有0.9 μmol/L TDZ培養基中誘導得到的小苗轉移到含有22.2 μmol/L NAA的MS4培養基中誘導生根，培養8周后，所有的47株外植體都能產生初級根和次生根（圖1e）。

2.2 體胚愈傷組織誘導

棕櫚科植物誘導愈傷難，時間長，但近期報道從油棕未成熟雄性花序成功誘導愈傷，其中加有激素picloram的愈傷誘導率為82%，萘乙酸的誘導率為54%[10]。鐵皮石斛已經建立了一個高效愈傷誘導率的體系，將原球莖片段放在1/2 MS培養基上，輔有NAA，6-BA，2，4-D等激素，其中以8.8 μmol/L 6-BA的培養基中愈傷誘導率最高[9]。綜合以上信息，采用愈傷誘導培養基對已經萌發成苗的小植株的莖尖、根尖及側根、子葉等部位以及胚簇進行愈傷組織的誘導，結果顯示（表2），子葉和莖尖部位可以形成愈傷，根部和剛萌發出的體胚不能形成愈傷組織。picloram和2，4-D誘導莖尖效果最好，6-BA次之，picloram和2，4-D對子葉愈傷組織誘導無效，結果表明，莖尖是鋸葉棕最佳的愈傷誘導材料。

3 討論

鋸葉棕跟其他棕櫚一樣，是多年生木本單子葉植物，未成熟合子胚是胚胎發生最好的外植體。但本試驗利用的是成熟的種子，體胚的形成也只需約1.5月。油棕成熟合子胚添加450 μmol/L picloram和2.5 g/L活性炭的胚性愈傷組織誘導率可以達到97.5%[10]。活性炭由于其能吸附芳香族化合物，因此可以吸附酚類物質，使多酚氧化酶和過氧化物酶失活[12]，此特性在棕櫚組織培養中降低外植體的褐化、增強再生方面起到非常重要的作用[13]。因此，棕櫚組培中加活性炭是常見的方法[14]。不加活性炭的培養基，氧化性太高，所有的合子胚都褐化而不能萌發，一旦加有活性炭，沒有氧化和酶類積累，在2周內胚可以膨大到原來體積的4倍。5周后所有的外植體開始長出半透明的胚簇。由于活性炭也可以吸附植物生長調節因子，它也可能對組培產生負面影響。通過放射性示蹤劑顯示，100 μmol/L 2，4-D在5 d內被0.25%的活性炭吸附掉99.5%[15]，然而，本試驗使用半固體培養基、減少活性炭濃度和增加2，4-D濃度可以增加2，4-D可利用率。雖然還不清楚在含有0.15%活性炭的半固體培養基中，452 μmol/L 2，4-D可利用的準確百分比，但是這些培養條件大大增加了自由2，4-D的數量，這樣就有足夠的可利用2，4-D來誘導胚胎發生。

棕櫚植物主要用種子進行繁殖，棕櫚植物的種子播種后發芽難，發芽時間長，出苗不整齊是其特點，也是生產中的難點[16]。幼苗的愈傷誘導中，莖尖是最好的誘導材料，2，4-D和picloram是最佳的激素誘導劑，但在實驗中發現，從1粒種子誘導出的愈傷組織只分化成2～3株小苗，從接種到分化成苗，花時間半年有余，還達不到擴大數量的目的，所花時間、物力和人力也不少，所以在短期內用少量珍稀珍貴的引種品種，進行大量繁殖推廣較難，后續工作還需進一步研究。

4 小結

本研究中，鋸葉棕不經過愈傷過程直接再生，可以維護外植體來源的完整性，體細胞無性系變異較少，因此，這種再生體系更有利于繁殖棕櫚獨特基因型和種質資源保護。更多的研究旨在考察不同生長調節劑組合，以及不同基因型的響應，以便建立鋸葉棕最優的體外再生系統。

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