GCMS法測定動物組織中鹽酸克倫特羅前處理方法的研究

俞慧紅

摘要[目的]建立一種簡單、準確、快速而又重現性好的氣相色譜-質譜聯用法（GCMS）測定動物組織中鹽酸克倫特羅的預處理方法。[方法]以豬肝為原料，預處理方法是樣品在堿化的條件下用乙酸乙酯提取，用酸性水溶液反萃取，SCX固相萃取小柱凈化，經雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BTSFA）衍生后，再采用氣質聯用儀進行檢測其鹽酸克倫特羅的含量。[結果]研究顯示，該方法下鹽酸克倫特羅的回收率為85%～95%，檢出限可達0.5 μg/kg。[結論]采用氣相色譜-質譜聯用法測定動物組織中鹽酸克倫特羅的精密度高，重現性好，方法可靠。

關鍵詞鹽酸克倫特羅；動物組織；預處理；氣相色譜-質譜聯用法

中圖分類號S851.34+7文獻標識碼A文章編號0517-6611（2016）04-130-03

Pretreatment of Clenbuterol Hydrochloride in Animal Tissue Detection by GCMS Method

YU HuiHong （Food and Drug Inspection and Testing Center of Cixi City，Cixi，Zhejiang 315300）

Abstract [Objective] To establish a simple，accurate，rapid and repeatable GCMS method，which was a pretreatment method to detect the clenbuterol hydrochloride in animal tissues.[Method] With pig liver as the raw material，extraction was carried out in alkaline condition by ethyl acetate.Acidic aqueous solution was used for backextraction.After purification by SCX solid phase extraction column，and derivation by doubletrimethylsilyl trifluoroacetamide （BTSFA），GCMS was used for detection.[Result] The recovery rate of clenbuterol hydrochloride was 85%95%； and detection limit reached 0.5 μg/kg.[Conclusion] Detecting clenbuterol hydrochloride in animal tissues by GCMS has high precision，good repeatability and reliable results.

Key wordsClenbuterol hydrochloride； Animal tissue； Pretreatment； GCMS

鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CLB），其化學名為羥甲叔丁腎上腺素或2[（叔丁氨基）甲基]4氨基3，5二氯苯甲醇鹽酸鹽，藥品名為雙氯醇胺、克喘素、氨哮素。它是強效選擇性β2受體激動劑，有強而持久的松弛支氣管平滑肌的作用，將其添加于飼料中，能促進家畜生長，減少酮體脂肪沉積，提高瘦肉率，故又稱“瘦肉精”。但食用含鹽酸克倫特羅較高的動物組織后，人體會出現肌肉顫動、肌痛、心動過速，甚至惡心、頭暈目眩等中毒癥狀[1]。

目前，鹽酸克倫特羅的檢測方法已經比較成熟，我國現有的檢測標準主要有國家標準GB/T 5009.192-2003《動物性食品中克倫特羅殘留量的測定》[2]、農業部推薦性標準NY/T 468-2006《動物組織中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜/質譜法》[3]，檢測方法主要集中在酶免疫分析法、高效液相色譜法、氣質聯用儀法等。無論采用哪種方法，前處理的技術要求很高，檢測過程繁瑣，難于操作，容易出差錯，要求檢測人員專業性強且具有豐富的實際操作經驗[4]。樣品的前處理技術得當與否，將直接影響測定試驗結果。我國一般將酶免疫分析法作為篩選法，液相色譜法作為半確證法，氣質聯用法作為確證和仲裁方法，因此，筆者針對氣質聯用法中樣品前處理過程的注意事項展開了討論，以期得到更加準確、有效的檢測數據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料樣品。豬肝，購于慈溪滸山菜市。

1.1.2主要試劑。鹽酸克倫特羅標準品（純度99.2%），德國DR公司；雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BTSFA）衍生劑，阿拉丁公司；SCX小柱（500 mg，3 mL），美國安捷倫公司；甲醇、甲苯、乙酸乙酯為色譜純試劑，美國天地公司；鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、氨水、甲醇均為分析純，國藥集團；高純氦氣（99.99%），上海浦江特種氣體有限公司；水為超純水，由優普超純水制造系統制備。

1.1.3主要儀器設備。7890A5975C氣質聯用儀、固相萃取儀，美國安捷倫公司；電子天平（0.01 mg），瑞士梅特勒公司；電子天平（0.01 g），美國賽多利斯公司；T18勻質器、MS3漩渦混合器，德國IKA公司；真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HSC24A氮吹儀，南京科捷分析儀器有限公司；DGG9240B烘箱，上海森信實驗儀器有限公司；TGL20W離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2方法

1.2.1標準溶液配制。標準品儲備溶液：稱取鹽酸克倫特羅標準品50.40 mg（有效濃度99.2%，折算后有效成分為50.00 mg），用甲醇定容至50 mL容量瓶，配成1.0 mg/mL鹽酸克倫特羅標準儲備溶液。

標準品中間溶液：吸取1 mL上述標準品儲備溶液用甲醇定容至100 mL，稀釋得到濃度為10 μg/mL鹽酸克倫特羅標準溶液，同樣方法，稀釋得到200 μg/L鹽酸克倫特羅標準溶液。

標準溶液系列：各吸取100 μg/L鹽酸克倫特羅標準溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶，分別配成4、10、20、40、100 μg/L鹽酸克倫特羅標準溶液。

1.2.2儀器條件。氣相條件：色譜柱HP5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度280 ℃；柱流量1.0 mL；柱溫程序為120 ℃保持3 min，10 ℃/min升至230 ℃，保持10 min，25 ℃/ min升至270 ℃，保持5 min；不分流進樣；進樣體積1 μL。

質譜條件：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；EI電壓70 eV；容積延遲5 min；選擇特征離子m/z86、m/z212、m/z262、m/z277；定量離子m/z86。

1.2.3樣品處理及分析。

1.2.3.1樣品提取步驟。稱取經處理后的豬肝臟組織樣品5.00 g于第1支帶蓋50 mL塑料離心管，加15 mL乙酸乙酯，再加入3 mL 10.0%碳酸鈉溶液，10 000 r/min以上高速勻漿1 min，蓋上蓋子放入離心機以5 000 r/min的速度離心5 min；勻漿機轉子上會粘有很多樣品殘渣，再用第2支裝有10 mL乙酸乙酯的塑料離心管繼續以10 000 r/min高速勻漿1 min；取出離心好后的第1支塑料離心管，吸取上層有機溶劑于第3支塑料離心管；將第2支塑料離心管中10 mL乙酸乙酯加入第1支塑料離心管樣品殘渣中，漩渦混合器上混合1 min，5 000 r/min離心2 min，將上層有機溶液合并到第3支塑料離心管中；在收集的有機溶液中加入5 mL 0.10 moL/L的鹽酸溶液，漩渦混合儀混合30 s，再以5 000 r/min的速度離心2 min，吸取上層有機溶液至第4支塑料離心管；在第4支塑料離心管加入5 mL 0.10 moL/L的鹽酸溶液，漩渦混合儀混合30 s，再以5 000 r/min的速度離心2 min，吸取上層有機溶液將其棄去；合并第3支和第4支離心管下層水相。

1.2.3.2樣品凈化處理。SCX小柱依次用5 mL甲醇、5 mL純水、5 mL 30 mmoL/L鹽酸活化，控制流速1 mL/min，棄去流出液；將上述提取液上樣至固相萃取小柱，棄去流出液；上樣完畢，再依次用5 mL純水和5 mL甲醇淋洗柱子，棄去淋洗液，并將小柱抽干；再用5 mL 4%氨化甲醇進行洗脫，用帶蓋的玻璃離心管收集洗脫液。上樣時要特別注意控制過柱流速，最好在自身重力作用下自流，如果過柱過程中遇到堵塞，可以適當加壓，控制流速最好不要超過1 mL/min。根據NY/T 468-2006標準方法，樣品提取液需回調pH至5.2，但對于SCX小柱來說，可以不用回調pH。因為NY/T 468-2006標準中采用的硅膠基質的強陽離子交換小柱，硅膠在pH 2.0～7.5穩定，而SCX小柱填充的聚合物基質則在pH 1.0～14.0中均穩定存在。經過測試，SCX商品小柱不經過調整pH至5.2結果回收率也很好，都保持在85%～100%，而且還避免了調pH反復用酸度計測定時引起樣液損耗而帶來的影響。

1.2.3.3樣品衍生化。上述洗脫液在50 ℃水浴中氮吹至干，加入100 μL甲苯和100 μL硅烷化試劑雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA），試管加蓋后于漩渦混合儀混合30 s，放于預熱好的80 ℃烘箱衍生1 h，烘箱應該預先加熱至所定溫度80 ℃。同時吸取鹽酸克倫特羅標準溶液系列（4、10、20、40、100 μg/L）各0.5 mL到裝有4.5 mL 4%氨化甲醇溶液帶蓋的玻璃離心管中，50 ℃水浴中氮吹至干，同樣操作放烘箱衍生，處理好的樣液和標準系列溶液去衍生時，要注意同步進行，盡量避免衍生條件不一致。衍生完畢后，取出冷卻至室溫，加入0.3 mL甲苯，在漩渦混合儀振蕩30 s，轉移至進樣小瓶中，進行氣相色譜-質譜分析。衍生后樣液如果有殘渣，建議用0.22 μm有機濾膜進行過濾至小樣品瓶再上機分析。

2結果與分析

2.1方法線性關系、檢出限的測定標準品鹽酸克倫特羅經氣相色譜-質譜聯用法（GCMS）的分析結果見圖1和圖2。

2可知，在該試驗方法的條件下，所有試劑對檢測均無干擾，鹽酸克倫特羅標準品在GC色譜圖中出峰保留時間為12.978 min，其特征離子為m/z86、m/z212、m/z262、m/z277，定量離子為m/z86。

以標準系列溶液進樣，測定不同濃度標準系列溶液中鹽酸克倫特羅的峰面積。以各標準溶液濃度和對應的峰面積進行線性回歸，則有：Y=18.23X+7.283，r2=0.995 396，相關系數大于0.995，說明該方法適用于鹽酸克倫特羅的定量分析。將標準溶液稀釋至一定濃度的標準溶液，按照3倍信噪比得儀器檢出限為5.0 μg/L，方法檢出限為0.5 μg/kg。

2.2精密度和回收率經檢測，豬肝樣品中鹽酸克倫特羅為陰性（未檢出），稱取18份豬肝樣品作為空白樣品，選擇3組標準溶液（10、20、100 μg/L），分別向豬肝空白中加入0.50 mL，3個加標水平各做了6個平行回收試驗，計算精密度和回收率。

由表1可知，豬肝樣品中鹽酸克倫特羅各個濃度點的回收率在85%～95%，而相對標準偏差（RSD）在1.6%～2.2%，符合現行獸藥殘留的分析要求。

2.3樣品測試結果對慈溪市超市和農貿市場所售豬肉和豬肝進行抽樣檢查，共計32份，結果鹽酸克倫特羅均未檢出。

3結論與討論

3.1結論采用氣相色譜-質譜聯用法對動物組織中的鹽酸克倫特羅進行前處理，測得回收試驗的回收率在88%～94%，而相對標準偏差（RSD）在1.6%～2.2%，方法檢出限為0.5 μg/kg，說明該方法適用于鹽酸克倫特羅的定量分析。對32種豬肉和豬肝進行抽樣檢查，結果鹽酸克倫特羅均未檢出。

3.2討論由于鹽酸克倫特羅已經全面禁止在動物生產中應用，所以許多國家并沒有具體確定動物性產品中最大殘留限量值（MRL）。荷蘭規定，牛、馬肝臟鹽酸克倫特羅的MRL值為0.5 μg/kg；英國規定，可食性組織中MRL值為0.5 μg/kg；我國暫未規定。美國食品藥品管理局（FDA）和世界衛生組織（WHO）建議，動物組織中的鹽酸克倫特羅的MRL值為：肉0.2 μg/kg、肝0.6 μg/kg、腎0.6 μg/kg、脂肪0.2 μg/kg和奶0.05 μg/kg[5]。目前我國使用的液相色譜法、氣質聯用儀法的最低檢測限一般都在0.5 μg/kg以上；酶聯免疫法最低檢測限可達0.05 μg/kg，但假陽性很高，例如有資料報道，用酶聯法檢測牛組織中得鹽酸克倫特羅可產生6.8%的假陽性，另外有36.0%陽性樣品不能被確認[5]。檢測方法各有優缺點，無法同時滿足定性和定量2個方面的要求。所以，研究快捷、高效、操作簡單、價格低廉，且檢測限更低的方法迫在眉睫，真正從定性和定量2個方面實現鹽酸克倫特羅殘留的有效檢測。

參考文獻

[1] JANES L M，BOOTH N H.獸醫藥理學與治療學[M].馮淇輝，申葆和，戎耀方，譯.上海：上海科學技術文獻出版社，1985：52-85.

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[3] 吳銀良，劉素英，單吉浩，等.動物組織中鹽酸克倫特羅的測定 氣相色譜/質譜法：NY/T468-2006[S].北京：中國農業出版社，2006.

[4] 黃小潔，朱永仁.鹽酸克倫特羅檢測方法的比較和應用[J].現代農業科技，2011（15）：37-39.

[5] 劉國艷，柴春彥.動物性產品中鹽酸克倫特羅檢測方法進展[J].動物科學與動物醫學，2002，19（4）：32-34.