羥基紅花黃色素A對膠質瘤U251細胞增殖、遷移與侵襲的影響

袁玉梅　樓亞玲

浙江省湖州市中心醫院藥劑科，浙江湖州313000

羥基紅花黃色素A對膠質瘤U251細胞增殖、遷移與侵襲的影響

袁玉梅樓亞玲

浙江省湖州市中心醫院藥劑科，浙江湖州313000

目的研究羥基紅花黃色素A（HSYA）對人腦膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其作用機制。方法體外培養人腦膠質瘤U251細胞，經不同濃度（25、100、400 μmol/L）HSYA處理后分別采用四甲基偶氮唑藍法（MTT）、劃痕試驗和Transwell試驗觀察HSYA對U251細胞增殖、遷移和侵襲的影響，采用Western blot方法檢測基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的蛋白表達水平。結果與空白對照組比較，HSYA能降低U251細胞存活率，縮短細胞遷移距離，減少U251細胞穿膜數，差異均有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），同時，HSYA能下調MMP-2、MMP-9的蛋白表達。結論HSYA對腦膠質瘤U251細胞增殖、遷移及侵襲等具有抑制作用，其作用機制可能與下調MMP-2、MMP-9表達有關。

羥基紅花黃色素A；膠質瘤細胞；抑制作用

［Abstract］Objective To investigate the effects of hydroxysafflor yellow A（HSYA）on proliferation，migration and invasion of glioma U251 cells，and to explore its mechanism.Methods The human glioma U251 cells were cultured in vitro and treated with different concentrations of HSYA（25，100，400 μmol/L），then the methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay，scratch test and Transwell assay were used to observe the effects of HSYA on proliferation，migration and invasion of U251 cells respectively，and the expression levels of matrix metalloproteinase（MMP）-2 and MMP-9 were examined by Western blot assay.Results Compared with blank control group，the U251 cell viability in HSYA group was decreased，the migration distance was shortened，the number of penetrated cells was reduced obviously，the differences were all statistically significant（P＜0.01 or P＜0.05）.Moreover，HSYA could decrease the expression of MMP-2 and MMP-9.Conclusion HSYA has inhibitory effects for the proliferation，migration and invasion of glioma cells，and the mechanism may be related to the inhibition of MMP-2 and MMP-9 expression.

［Key words］Hydroxysafflor yellow A；Glioma cells；Inhibitory effect

神經膠質瘤是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，具有發病率、病死率和復發率高的特點。對于惡性膠質瘤的治療，現階段主要為手術切除，術后輔以放療和化療，但由于惡性膠質瘤的侵襲性強，術后容易復發，總體治療效果不理想。羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是中國傳統中藥紅花中含量最高的主要活性成分，具有顯著的藥理活性［1］。近年來多項研究表明HSYA具有抗腫瘤作用［2-4］，本研究觀察HSYA對膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲等作用，以及基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9等的表達情況，探討HSYA對膠質瘤細胞的抗腫瘤作用及機制，為研究高效、低毒的中藥抗腫瘤藥物提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1細胞培養

膠質瘤U251細胞（中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫）用含10%胎牛血清MEM培養基（美國Gibco公司）于37℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.2MTT法測定U251細胞增殖

取對數生長期的U251細胞，以2×104個/mL密度接種于96孔板，貼壁24 h后，經不同濃度HSYA（25、100、400 mmol/L）（中國食品藥品檢定研究院，批號111637-201308）、陽性對照替莫唑胺（100 mmol/L）（Sigma公司）處理72 h，加入MTT液使終濃度為0.5 mg/mL，繼續培養4 h后，棄去孔內液體，加入100 mL二甲基亞砜（DMSO）溶解藍紫色復合物，震蕩10 min，于酶標儀上490 nm波長處測定吸光度值（A490）。細胞存活率=處理組A490/對照組A490×100%。

1.3劃痕試驗檢測U251細胞遷移

將對數生長期的U251細胞按照5×104個/mL密度接種于96孔板中培養，細胞貼壁后，用無菌100 mL槍頭于細胞層中橫向劃線，形成寬度均勻一致的劃痕，造成細胞傷口模型，在顯微鏡下拍照，測定劃痕寬度。24 h后測定劃痕寬度。使用Image軟件測量劃痕距離，每條劃痕取3個測量點，計算平均寬度值。

1.4Transwell試劑盒檢測U251細胞的侵襲能力

采用Transwell小室法構建侵襲模型，用無血清MEM將U251細胞濃度調整至5×105個/mL，取0.25 mL加入Transwell上室，同時進行藥物干預（HSYA100mmol/L，陽性對照組替莫唑胺100 mmol/L），下室中加入0.5 mL含有10%胎牛血清的MEM。置細胞培養箱培養72 h后取出小室并棄去小室內液體，將小室置入0.1%結晶紫染色液中染色20 min，純凈水清洗后以棉簽拭去小室濾膜上表面的細胞，干燥后使用200 μL醋酸脫色液脫色15 min，取100 μL至96孔板檢測560 nm的OD值。

1.5Western blot檢測MMP-2、MMP-9的蛋白表達

U251細胞經HSYA處理后，裂解細胞提取細胞總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白質行10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉膜后5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗人MMP-2、MMP-9單抗（Cell signaling公司，1∶1000）4℃孵育過夜，加入HRP標記的羊抗兔二抗（上海康成公司）孵育2 h，最終用X線膠片曝光分析。內參對照使用β-actin（上海康成公司）。

1.6統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間數據比較采用One way-ANOVA，組間比較采用Tukey法進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1HSYA對U251細胞增殖的影響

MTT法檢測結果顯示，與空白對照組比較，不同濃度的HSYA（100、400 mmol/L）能顯著性降低U251細胞的存活率［分別為正常對照的（87.7±3.7）%與（77.0±3.7）%］，抑制U251細胞的增殖，并具有濃度依賴性。與陽性對照組替莫唑胺比較，高濃度的HSYA（400 mmol/L）對U251細胞有較強的抑制增殖作用，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1　HSYA對膠質瘤U251細胞增殖的影響

2.2HSYA對U251細胞遷移的影響

采用體外劃痕法觀察HSYA對U251細胞遷移能力的影響，劃痕的寬度由于細胞的遷移變小，并逐漸融合。結果顯示，與空白對照組比較，HSYA組細胞遷移距離減小，中、高濃度的HSYA組（100、400 mmol/L）U251細胞遷移距離分別為空白對照組的（88.8± 9.5）%與（75.4±17.5）%，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2），表明HSYA能抑制U251細胞的遷移。

圖2　HSYA對U251細胞遷移能力的影響（400×）

2.3HSYA對U251細胞侵襲的影響

Transwell小室法檢測結果（圖3）顯示，HSYA（100 mmol/L）組與陽性對照替莫唑胺組（100 mmol/L）相似，560 nm OD值較對照組明顯下降，提示穿過Transwell小室濾膜的U251細胞數明顯減少（圖3），表明HSYA能降低U251細胞的侵襲能力。

2.4HSYA對U251細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與空白對照組比較，經HSYA干預處理的U251細胞MMP-2與MMP-9蛋白表達水平下調（圖4），與陽性對照替莫唑胺結果類似，提示HSYA對U251細胞的抑制作用可能與MMP-2、MMP-9兩種侵襲相關蛋白表達相關。

圖3　HSYA對U251細胞侵襲能力的影響（200×）

圖4　HSYA對U251細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

3　討論

紅花黃色素是中藥紅花發揮藥理作用的物質基礎，而HSYA是其中含量最高的活性成分，目前臨床上主要因為其抗血小板聚集、保護心肌細胞等作用而廣泛用于心腦血管疾病［5-7］。近年來較多研究表明紅花黃色素具有抑制腫瘤作用，如胃癌［2，8］、肝癌［3］、乳腺癌［4］、肺癌［9］等。

但相關研究中，大部分多集中在HSYA對腫瘤新生血管生成的抑制研究上，如有研究結果表明，HSYA能通過抑制內皮細胞增殖與遷移等抑制腫瘤血管生成［10-13］。而對于HSYA在腫瘤細胞本身上的抑制作用研究較少，本研究在膠質瘤U251細胞中明確了HSYA的腫瘤抑制作用。結果表明，一定濃度的HSYA能顯著性抑制U251細胞的增殖，且抑制作用呈濃度依賴性，與陽性對照替莫唑胺比較，HSYA對U251細胞的抑制作用不弱于替莫唑胺。

膠質瘤的高侵襲性是膠質瘤患者高復發的重要原因，而細胞的遷移及侵襲能力是影響細胞侵襲性的關鍵因素［14］。有研究表明某些中成藥能通過抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲從而發揮抗腫瘤作用［15］。本研究通過劃痕試驗及Transwell侵襲試驗提示，HSYA能有效抑制U251細胞的遷移與侵襲，隨著濃度的增加，HSYA抑制U251細胞遷移的作用增強。

MMPs是一類降解細胞外基質蛋白的鋅離子依賴蛋白酶，MMP-2和MMP-9為MMPs中的明膠酶，能降解血管周圍基膜主要成分Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白，利于腫瘤細胞沿基底膜侵入周圍組織［16-17］。研究表明［18-19］，膠質瘤的高侵襲性與MMP-2及MMP-9的表達活性相關。近期有研究［20］顯示，MMP-9與膠質瘤的分級相關，低表達的MMP-9在患者中具有更好的生存結果，同時對于膠質瘤化療經典用藥替莫唑胺具有更好的敏感性。因此，MMPs在膠質瘤中的表達對膠質瘤的侵襲以及化療藥物的反應性起重要作用。本研究結果發現，HSYA能顯著性下調U251細胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達，表明HSYA對膠質瘤U251細胞的抑制作用可能與下調MMP-2和MMP-9兩種侵襲性相關蛋白的表達有關。而奚勝艷等［21］研究也發現HSYA能下調胃癌組織中MMP-9的表達。

綜上所述，HSYA作為一種中藥單體成分，對膠質瘤U251細胞的增殖、遷移以及侵襲均具有抑制作用，其抑制作用的機制可能與HSYA下調MMP-2和MMP-9的蛋白表達相關。本研究結論為進一步深入探討HSYA對膠質瘤抑制作用的機制及為臨床上探尋HSYA用于膠質瘤的治療靶點提供實驗依據，為尋找高效低毒的抗腫瘤中藥成分提供新思路。

［1］Meselhy MR，Kadota S，Momose Y，et al.Two new quinochalcone yellow pigments from Carthamus tinctorius and Ca2+antagonistic activity of tinctormine［J］.Chem Pharm Bull（Tokyo），1993，41（10）：1796-1802.

［2］奚勝艷，張前，劉朝陽，等.羥基紅花黃色素A對裸鼠人胃腺癌BGC-283移植瘤抑制作用的研究［J］.北京中醫藥大學學報，2009，32（5）：331-335.

［3］Yang F，Li J，Zhu J，et al.Hydroxysafflor yellow A inhibits angiogenesis of hepatocellular carcinoma via blocking ERK/MAPK and NF-kappa B signaling pathway in H22 tumor-bearing mice［J］.Eur J Pharmacol，2015，754：105-114.

［4］劉冉.注射用紅花黃色素聯合GP方案治療中晚期乳腺癌的臨床觀察［J］.中國藥房，2016，27（2）：231-233.

［5］Zhu H，Wang Z，Ma C，et al.Neuroprotective effects of hydroxysafflor yellow A：in vivo and in vitro studies［J］. Planta Med，2003，69（5）：429-433.

［6］Wang J，Zhang Q，Mei X，et al.Hydroxysafflor yellow A attenuatesleftventricularremodelingafterpressure overload-induced cardiac hypertrophy in rats［J］.Pharm Biol，2014，52（1）：31-35.

［7］Hu T，Wei G，Xi M，et al.Synergistic cardioprotective effects ofDanshensuandhydroxysaffloryellowAagainstmyocardial ischemia-reperfusion injury are mediated through the Akt/ Nrf2/HO-1 pathway［J］.Int J Mol Med，2016，38（1）：83-94.

［8］奚勝艷，張前，劉朝陽，等.紅花組分HSYA對人胃腺癌BGC-823移植瘤裸鼠VEGF蛋白、KDR與缺氧誘導因子表達的影響［J］.中華中醫藥雜志，2012，27（1）：82-87.

［9］高亭，蔣引娣，李敏，等.羥基紅花黃色素A對小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用［J］.實用癌癥雜志，2016，31（3）：356-358.

［10］張前，牛欣，解華，等.紅花有效成分抑制雞胚尿囊膜血管生成的實驗研究［C］//全國中醫藥科研與教學改革研討會論文集，2004.

［11］王濟，張前，解華，等.羥基紅花黃色素A對腫瘤上清誘導的人臍靜脈內皮細胞增殖的影響［J］.中華中醫藥雜志，2009，24（5）：572-575.

［12］Xi SY，Zhang Q，Liu CY，et al.Effects of hydroxy safflower yellow-A on tumor capillary angiogenesis in transplanted human gastric adenocarcinoma BGC-823 tumors in nude mice［J］.J Tradit Chin Med，2012，32（2）：243-248.

［13］王濟，張前，顧立剛，等.羥基紅花黃色素A對腫瘤上清誘導的人臍靜脈內皮細胞周期及凋亡的影響［J］.北京中醫藥大學學報，2008，31（11）：741-744.

［14］Wan L，Pantel K，Kang Y.Tumor metastasis：moving new biological insights into the clinic［J］.Nat Med，2013，19：1450-1464.

［15］Liu JM，Zhang J，Huang LW，et al.XuefuZhuyu Tang exerts antitumor effects by inhibiting glioma cell metastasis and invasion via regulating tumor microenvironment［J］.Onco Targets Ther，2016，9：3603-3612.

［16］Deryugina EI，Quigley JP.Matrix metalloproteinases and tumor metastasis［J］.Cancer Metastasis Rev，2006，25（1）：9-34.

［17］Luo Z，Wang Q，Lau WB，et al.Tumor microenvironment：the culprit for ovarian cancer metastasis？［J］Cancer Lett，2016，377（2）：174-182.

［18］Aroui S，Najlaoui F，Chtourou Y，et al.Naringin inhibits the invasion and migration of human glioblastoma cell via downregulation of MMP-2 and MMP-9 expression and inactivation of p38 signaling pathway［J］.Tumour Biol，2016，37（3）：3831-3839.

［19］Zhang FY，Hu Y，Que ZY，et al.Shikonin inhibits the migration and invasion of human glioblastoma cells by targeting phosphorylated β-catenin and phosphorylated PI3K/Akt：a potential mechanism for the anti-glioma efficacy of a traditional Chinese herbal medicine［J］.Int J Mol Sci，2015，16（10）：23823-23848.

［20］Li Q，Chen B，Cai J，et al.Comparative analysis of matrix metalloproteinase family members reveals that MMP-9 predicts survival and response to temozolomide in patients with primary glioblastoma［J］.PLoS One，2016，11（3）：1-15.

［21］奚勝艷，張前，劉朝陽，等.羥基紅花黃色素A對人胃癌移植瘤裸鼠瘤組織bFGF蛋白及MMP-9表達的影響［J］.中國中藥雜志，2010，35（21）：2877-2881.

Effects of hydroxysafflor yellow A on proliferation，migration and invasion of glioma U251 cells

YUAN Yumei LOU Yaling
Department of Pharmacy，Huzhou Central Hospital，Zhejiang Province，Huzhou313000，China

R739.41

A

1673-7210（2016）09（c）-0015-04

2016-06-03本文編輯：張瑜杰）

浙江省湖州市自然科學資金項目（2013YZ11）。

袁玉梅（1983-），女，碩士；研究方向：神經藥理。