一株假單胞菌降解間甲酚的特性研究★

石高科 王 孟 賈子龍

(1.諸暨市規(guī)劃設(shè)計(jì)院，浙江 諸暨 311800； 2.太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030024)

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·水·暖·電·

一株假單胞菌降解間甲酚的特性研究★

石高科1王 孟2賈子龍2

(1.諸暨市規(guī)劃設(shè)計(jì)院，浙江 諸暨 311800； 2.太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原 030024)

假單胞菌，間甲酚，生物降解，反硝化

含酚廢水產(chǎn)生于石油化工、煤氣、煉焦、印染等生產(chǎn)工藝中，間甲酚是酚類(lèi)污染物的代表物質(zhì)之一，常用作防腐劑、除草劑、殺菌劑、有機(jī)溶劑等，具有較高的毒性，在較低濃度時(shí)便會(huì)對(duì)人類(lèi)和環(huán)境造成嚴(yán)重威脅。盡管間甲酚對(duì)微生物有極強(qiáng)的抑制作用，但仍有眾多學(xué)者分離出具有較高降解間甲酚能力的微生物，主要包括Citrobacter farmeri[1]，Lysinibacillus cresolivorans[2]，Bacillus cereus[3]，Brevibacillus borstelensis[4]等。

近年來(lái)，好氧反硝化現(xiàn)象不斷被發(fā)現(xiàn)，好氧反硝化菌的分離及其反硝化性能的研究得到了迅速發(fā)展，利用好氧反硝化菌進(jìn)行生物脫氮，突破了傳統(tǒng)理論的認(rèn)識(shí)，為生物脫氮技術(shù)提供了全新的途徑，大大降低了投資費(fèi)用和運(yùn)行成本。目前已報(bào)道的好氧反硝化菌包括Pseudomonas sp.Y2-1-1[5]，Pseudomonas stutzeri[6]，Diaphorobacter sp.PDB3[7]等。

1 材料和方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

假單胞屬細(xì)菌Pseudomonas sp.BN5從活性污泥中分離得到[8]。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，pH 7.2，用高壓蒸汽滅菌鍋在121 ℃下滅菌20 min。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L)：NaNO30.15，KH2PO40.5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.2, CaCl 0.1，MnSO4·H2O 0.01，Na2MoO4·2H2O 0.01，F(xiàn)e2(SO4)3·H2O 0.01，pH 7.2，用高壓蒸汽滅菌鍋在121 ℃下滅菌20 min。

用0.2 μm孔徑纖維膜過(guò)濾間甲酚，在接種前加入培養(yǎng)基中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1)間甲酚降解及反硝化特性。考察Pseudomonas sp.BN5對(duì)不同初始濃度間甲酚的降解情況、細(xì)胞生長(zhǎng)及反硝化特性。間甲酚初始濃度為0 mg/L～300 mg/L，各濃度培養(yǎng)基設(shè)置一個(gè)沒(méi)有接種菌的空白對(duì)照，以消除底物揮發(fā)造成的影響。

2)細(xì)胞粗酶液提取。將菌株分別接種至含100 mg/L間甲酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基和不含間甲酚的LB培養(yǎng)基中，用搖床在30 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，取10 mL菌液，在4 ℃，10 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液(pH=7)清洗菌體兩次，重懸細(xì)胞后置于冰水混合物中，用超聲破碎儀(型號(hào)JY92-IIN)破碎細(xì)胞，離心20 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3 測(cè)試與分析方法

2 結(jié)果與討論

2.1 間甲酚降解及酶活分析

圖1為細(xì)胞生長(zhǎng)和間甲酚降解曲線。間甲酚降解同步于細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，間甲酚的利用率提高，并于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期達(dá)到最大。菌體Pseudomonas sp.BN5分別在30 h，42 h和58 h內(nèi)降解100 mg/L，200 mg/L及300 mg/L的間甲酚，隨著間甲酚濃度升高,底物抑制作用增強(qiáng)，降解難度增大。

細(xì)胞生長(zhǎng)半對(duì)數(shù)曲線的斜率表示細(xì)胞比生長(zhǎng)速率。如圖1所示，隨著間甲酚濃度的提高，細(xì)胞生長(zhǎng)的延滯期增長(zhǎng)，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率降低，菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞濃度快速增長(zhǎng)。隨著間甲酚濃度的增加，最終細(xì)胞濃度也相應(yīng)提高。菌體降解300 mg/L苯酚只需18 h，比降解同質(zhì)量濃度間甲酚縮短40 h，表明間甲酚比苯酚難于降解。

菌株對(duì)間甲酚的最大降解能力考察見(jiàn)圖2。當(dāng)間甲酚濃度從320 mg/L上升到360 mg/L時(shí)，由于底物濃度增加，菌體生長(zhǎng)的延滯期逐漸增長(zhǎng)，底物降解所用的時(shí)間也延長(zhǎng)。在初始間甲酚濃度為400 mg/L的培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)十分緩慢，間甲酚的降解速率也一直較低，經(jīng)過(guò)90 h降解后，培養(yǎng)基中間甲酚的降解量?jī)H為初始總濃度的31%；100 h后菌體增長(zhǎng)基本停滯，間甲酚濃度也不再降低，因此，菌株P(guān)seudomonas sp.BN5對(duì)間甲酚的最大降解能力為360 mg/L。

在有氧條件下，間甲酚被羥化生成鄰苯二酚，接著鄰苯二酚-1,2-雙加氧酶或鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶催化鄰苯二酚鄰位或間位開(kāi)環(huán)，產(chǎn)物最終經(jīng)降解途徑進(jìn)入三羧酸循環(huán)。測(cè)定菌株P(guān)seudomonas sp.BN5粗酶液中C12O和C23O的活性，結(jié)果如表1所示。在唯一碳源為間甲酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，菌體粗酶液中C23O比活力為0.065 U/mg蛋白質(zhì)，C12O比活力僅為0.005 U/mg蛋白質(zhì)，因此該菌株降解間甲酚以間位開(kāi)環(huán)為主。菌體破碎后上清液中C23O的活性遠(yuǎn)高于未破碎菌體上清液中酶活性，表明該酶為胞內(nèi)酶。以LB培養(yǎng)基(不含間甲酚)為基質(zhì)的兩種上清液中均未檢測(cè)到酶的活性，說(shuō)明該菌株C23O是誘導(dǎo)酶。

表1 不同基質(zhì)中鄰苯二酚雙加氧酶活力

2.2 菌株的好氧反硝化特性

2.3 間甲酚降解動(dòng)力學(xué)

鑒于間甲酚抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，采用Haldane方程描述細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，方程為:

(1)

其中，μmax為細(xì)胞最大比生長(zhǎng)速率，h-1；S為限制性底物濃度，mg/L；Ks為飽和常數(shù)，mg/L；Ki為抑制常數(shù)，mg/L。

選取初始濃度為0 mg/L，20 mg/L,40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L，100 mg/L，150 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，360 mg/L的間甲酚。用Matlab軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘擬合，所得擬合曲線如圖5所示，模型預(yù)測(cè)與試驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合良好。動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：μmax=0.202 h-1，Ks=9.85 mg/L，Ki=101.91 mg/L，決定系數(shù)R2=0.989。從圖5可見(jiàn)，隨著間甲酚濃度升高，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率μ先增大后減小，μ在間甲酚濃度約40 mg/L時(shí)達(dá)到最大；隨著間甲酚濃度繼續(xù)增大，μ逐漸降低，底物抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)間甲酚濃度小于40 mg/L并逐漸降低時(shí)，μ迅速降低，這是由于培養(yǎng)基中缺乏足夠的碳源，底物限制作用占主導(dǎo)地位。

3 結(jié)語(yǔ)

1)菌株P(guān)seudomonas sp.BN5能夠以間甲酚為唯一碳源、能源生長(zhǎng)，其降解間甲酚的最大能力為360 mg/L，高濃度間甲酚對(duì)菌株生長(zhǎng)有一定的抑制作用，且間甲酚濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。代謝機(jī)制研究表明，間甲酚可誘導(dǎo)該菌合成鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶，從而使間甲酚發(fā)生間位裂解。

3)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)符合Haldane方程，動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：μmax=0.202 h-1，Ks=9.85 mg/L，Ki=101.91 mg/L，決定系數(shù)R2=0.989。間甲酚濃度約40 mg/L時(shí)，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大。

菌株P(guān)seudomonas sp.BN5能在好氧條件下進(jìn)行高效反硝化，并具有較高的降解酚類(lèi)化合物的能力，可應(yīng)用于實(shí)際含酚廢水處理，同時(shí)達(dá)到脫氮除碳的目的，這可為今后高效降解酚類(lèi)污染物工藝的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

[1] 彭麗花,任 源,鄧留杰,等.間甲酚降解菌Citrobacter farmeri的降解特性及代謝途徑解析[J].環(huán)境化學(xué),2015,28(1):44-48.

[2] 李 婷,任 源,韋朝海.固定化Lysinibacillus cresolivorans的PVA-SA-PHB-AC復(fù)合載體制備及間甲酚的降解[J].環(huán)境科學(xué),2013,34(7):2899-2905.

[3] 于晨陽(yáng),毛 縝.蠟狀芽孢桿菌菌株SMC的間甲酚降解特性及動(dòng)力學(xué)[J].化工進(jìn)展,2015(5):1453-1458.

[4] 賈子龍,王國(guó)英,岳秀萍,等.波茨坦短芽孢桿菌降解間甲酚和苯酚的特性[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2015(11):37-41.

[5] 孔慶鑫,李君文,王新為,等.一種新的好氧反硝化菌篩選方法的建立及新菌株的發(fā)現(xiàn)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2005,11(2):222-225.

[6] 李衛(wèi)芬,傅羅琴,鄧 斌,等.1株好氧反硝化菌的分離鑒定及反硝化特性研究[J].環(huán)境科學(xué),2011,32(8):2403-2408.

[7] 王國(guó)英,崔 杰,岳秀萍,等.異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌脫氮同時(shí)降解苯酚特性[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué),2015,35(9):2644-2649.

[8] 李 媛.一株異養(yǎng)硝化—好氧反硝化苯降解菌的分離鑒定及特性研究[D].太原：太原理工大學(xué),2015.

[9] Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72(1-2):248-54.

[10] 張鳳君,戴 寧,李 卿,等.活性污泥法馴化篩選好氧反硝化菌的試驗(yàn)研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2006,26(11):1084-1088.

The characteristic study of m-cresol biodegradation by Pseudomonas sp.★

Shi Gaoke1Wang Meng2Jia Zilong2

(1.ZhujiPlanning&DesignInstitute,Zhuji311800,China; 2.CollegeofEnvironmentScience&Engineering,TaiyuanUniversityofTechnology,Taiyuan030024,China)

Pseudomonas sp., m-cresol, biodegradation, denitrification

1009-6825(2016)24-0127-04

2016-06-14★:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：51378330,51408396)

石高科(1984- )，男，工程師； 王 孟(1991- )，男，在讀碩士； 賈子龍(1988- )，男，在讀碩士

O625.311

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