宮頸鱗癌組織中血管生成擬態與HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達變化及意義

陳瑜，李爭，王振國

(1河北北方學院，河北張家口075000；2中國人民解放軍第309醫院)

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宮頸鱗癌組織中血管生成擬態與HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達變化及意義

陳瑜1，李爭1，王振國2

(1河北北方學院，河北張家口075000；2中國人民解放軍第309醫院)

目的觀察宮頸鱗癌(CSCC)組織中血管生成擬態(VM)與缺氧誘導因子1α(HIF-1α)及上皮間質轉化(EMT)相關蛋白(E-cadherin和Vimentin)的表達，并探討其臨床意義。方法 收集CSCC組織標本43例(CSCC組)和正常宮頸組織切片20例(對照組)，以HE、CD34-PAS雙重染色檢測VM情況，免疫組化法檢測HIF-1α、E-cadherin、Vimentin，分析各指標間及其與臨床病理特征的關系。結果 CSCC組16例存在VM，對照組無VM，P<0.05；CSCC組HIF-1α、E-cadherin、Vimentin陽性表達率分別為60.5%、37.2%、32.6%，對照組分別為20.0%、100%、0，P均<0.05。VM與CSCC分化程度、臨床分期及淋巴結轉移、脈管癌栓形成有關，HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達均與病理分級有關，Vimentin表達與淋巴結轉移、脈管癌栓形成有關，HIF-1α表達與淋巴結轉移、腫瘤直徑有關，P均<0.05。CSCC組織中VM與HIF-1α、Vimentin表達呈正相關(r=0.426、0.697，P均<0.05)，與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.394，P<0.05)；HIF-1α與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.362，P<0.05)，與Vimentin表達呈正相關(r=0.359，P<0.05)；E-cadherin與Vimentin表達呈負相關(r=-0.330，P<0.05)。同一標本表達定位觀察，發現存在VM者有56.2%(9/16)HIF-1α陽性時伴隨E-cadherin陰性表達、Vimentin陽性表達，無VM者HIF-1α陽性時不存在(0/27)這樣的對應關系，差異有統計學意義(χ2=15.959,P<0.05)。結論 VM、HIF-1α、E-cadherin和Vimentin的表達與CSCC的侵襲轉移密切相關；高侵襲性CSCC中HIF-1α可能通過下調E-cadherin、上調Vimentin的表達誘導EMT，促進VM的形成。

血管生成擬態；缺氧誘導因子1α；上皮間質轉化；E-鈣黏蛋白；波形蛋白；宮頸鱗癌

子宮頸癌是目前全球女性第三大常見惡性腫瘤[1]，其主要病理類型為鱗癌。眾所周知，腫瘤的生長具有血管依賴性，但抗血管治療效果又具局限性[2]，因此尋找新的抗癌靶標顯得十分重要。近年來，血管生成擬態(VM)作為腫瘤功能性微循環中傳統內皮血管外的補充在惡性腫瘤中的研究越來越多，與腫瘤的侵襲、轉移密切相關[3]。有研究發現，缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、上皮間質轉化(EMT)在VM形成及腫瘤侵襲轉移中發揮重要作用[4]。本研究檢測了VM、HIF-1α及EMT相關蛋白[E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)]在宮頸鱗癌(CSCC)組織中的表達，并分析各指標之間及其與CSCC臨床病理特征的關系，為CSCC的研究提供新思路。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集中國人民解放軍第309醫院2011年8月～2015年3月行手術切除的CSCC患者43例(CSCC組)，術前未行化療、放療及免疫治療等腫瘤特異性治療，術中取腫瘤組織制作石蠟標本。患者年齡25～77歲，其中≥50歲18例、<50歲25例；腫瘤直徑>4 cm 11例，≤4 cm 32例；臨床分期：Ⅰa～Ⅰb期27例，Ⅱa～Ⅱb期16例；組織學分級：低分化23例，中、高分化20例；伴淋巴結轉移11例，有脈管癌栓形成29例。另取同期子宮肌瘤患者手術切除的正常宮頸組織標本20例作為對照組。

1.2檢測方法

1.2.1VM采用HE、CD34-PAS雙重染色法。首先進行CD34免疫組織化學染色，于DAB顯色后顯微鏡下觀察；待血管內皮細胞著色后，流水沖洗1 min，終止顯色反應，蒸餾水水洗3遍。滴加PAS試劑盒試劑Ⅰ 0.5%高碘酸溶液1滴，染色10 min，流水沖洗1 min，蒸餾水水洗3遍；滴加試劑Ⅱ Schiff液1滴，閉光濕盒37 ℃恒溫反應15 min(目測組織變紅)終止，流水沖洗1 min。蘇木素復染、分化、返藍、脫水、透明、封片等步驟同常規染色。 VM的判定：CD34陽性顆粒表達于血管內皮細胞胞質(膜)，PAS陽性表達于血管或類血管腔壁的基膜，呈紫紅色或櫻桃紅色。由CD34陰性的腫瘤細胞(HE光鏡下確認)圍成的內有一層PAS陽性基膜樣物質的不規則血管樣結構，有時其內可見紅細胞，管道周圍無出血、壞死及明顯的炎細胞，判定為VM。

1.2.2HIF-1α、Vimentin及E-cadherin采用免疫組化PV-6000兩步染色法。HIF-1α抗體工作濃度為1∶100，Vimentin及E-cadherin抗體為即用型單抗。將石蠟組織3 μm厚連續切片，常規脫蠟、水化；高壓熱修復后自然冷卻，以3%H2O2作用14 min，PBS沖洗2 min×3次；5%正常山羊血清封閉20 min；滴加一抗，4 ℃過夜或37 ℃溫箱孵育75 min，PBS沖洗2 min×3次；滴加二抗，37 ℃溫箱孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次；DAB顯色，蘇木素復染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。HIF-1α、E-cadherin和Vimentin蛋白陽性顆粒分別表達于細胞核(質)、細胞膜(質)、細胞質，結果由2名病理醫師雙盲閱片。總積分=染色強度積分×陽性細胞比例積分。染色強度無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計為0、1、2、3分，陽性細胞數百分數0、>0～10%、>10%～50%、>50%～80%、>80%分別計為0、1、2、3、4分。兩項得分相乘0～3為陰性，>3為陽性。

1.3統計學方法采用SPSS20.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗及Fisher確切概率法，相關性檢驗采用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組VM存在情況及HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達比較見表1。

表1　　　　兩組VM存在情況及HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達比較(例)

2.2VM存在情況及HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達與CSCC臨床病理特征的關系見表2。

表2　VM存在情況及HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達與CSCC臨床病理特征的關系[例(%)]

2.3CSCC組織中VM、HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達的關系CSCC組織中VM與HIF-1α、Vimentin表達呈正相關(r=0.426、0.697，P均<0.05)，與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.394，P<0.05)；HIF-1α表達與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.362，P<0.05)，與Vimentin表達呈正相關(r=0.359，P<0.05)；E-cadherin與Vimentin表達呈負相關(r=-0.330，P<0.05)。同一標本的表達定位觀察發現，VM陽性患者中有56.2%(9/16)HIF-1α陽性時伴隨著E-cadherin陰性表達、Vimentin陽性表達，VM陰性患者HIF-1α陽性時不存在(0/27)這樣的對應關系，差異具有統計學意義(χ2=15.959,P<0.05)。

3　討論

VM與傳統的內皮血管不同，它不是由內皮細胞、而是由腫瘤細胞通過自身塑形及細胞外基質重塑圍成的能夠運輸血液的類血管樣管道，且與周圍血管相連通，是功能性微循環的一部分[5]。在體外3 D培養，細胞形成互相連接的環狀或網格狀結構[6]。研究報道，在多種具有高侵襲性的腫瘤中均存在VM，且存在VM的腫瘤細胞遷移侵襲能力更強，患者預后更差[7]。本研究結果顯示，CSCC組出現VM的頻率高于對照組，在低分化、Ⅱ期CSCC患者癌組織中的頻率高于中高分化、Ⅰ期患者，且隨著脈管癌栓的轉移、淋巴結轉移而增高。其原因可能為高侵襲性CSCC中VM的管道僅為連接比較松散的腫瘤細胞和一層基膜，缺乏內皮細胞的屏障保護，使腫瘤細胞更容易脫落進入血液循環而發生轉移；此外，形成VM的高侵襲性細胞通常具有多能胚胎樣干細胞基因型，推斷該種細胞形成VM的能力可能是其胚胎樣表型的多能表現之一，其多能表型特征保障了腫瘤細胞的重塑、灌注、細胞活力和傳播等機制[8]。

腫瘤難以調控的快速生長很容易造成其周圍微環境的缺氧狀態，HIF-1為腫瘤應對缺氧反應的重要因子，其亞單位HIF-1α更是直接受氧分壓調節，可作為組織缺氧的內在標志。HIF-1α可靶向調控VEGF、GLUT1、碳酸酐酶Ⅸ等基因的轉錄過程，從而誘發腫瘤血管生成及糖酵解的耗能方式，使其更能適應低氧低能的環境[9]，并能提高細胞抗凋亡、放療抵抗的能力[10]。本研究中，CSCC組HIF-1α表達明顯高于對照組，且隨著CSCC腫瘤病理分級的提高、體積的增大、淋巴結的轉移其陽性率也呈現出升高態勢(P均<0.05)。可能因腫瘤惡性程度越高，其組織細胞分裂能力越強，生長越快，腫瘤體積也就越大，從而使腫瘤更易處于膨脹壓力較高及缺氧的微環境，誘導HIF-1α的表達增高，使其在低氧環境中具有更強的生存力及轉移能力。有研究報道，HIF-1α可通過VEGF激發的VE-cadherin/EphA2/PI3K/MMPs/Laminin-5γ2關鍵通路促進VM的形成[11]。在我們的研究中，VM與HIF-1α表達呈正相關關系，也恰恰支持了CSCC組織中HIF-1α可能促進VM形成這一微觀機制。

EMT，即上皮細胞向間質細胞轉化的多步驟過程，其中以上皮表型E-cadherin的丟失以及間質表型Vimentin的獲得最為典型，可作為EMT過程的標志蛋白[12]。E-cadherin表達于上皮細胞的胞膜，與β-actin形成復合體增強細胞的黏附功能；Vimentin是典型表達于間質細胞的中間絲狀體蛋白，可動員細胞游走。大量研究表明，E-cadherin的丟失以及Vimentin的獲得使得腫瘤細胞失去極性，細胞間連接變得松散，細胞的運動遷徙、侵襲能力增強[13]。本研究結果發現，E-cadherin主要表達于正常宮頸組織及分化程度較高的CSCC胞膜，CSCC伴淋巴結轉移者其陽性率降低；而Vimentin則不表達于正常宮頸上皮，其往往表達于分化程度較低的腫瘤細胞的胞質，相反隨著淋巴結轉移、脈管癌栓轉移其陽性率增高；且二者在CSCC組織中的表達呈負相關。推測，CSCC可能發生了一定程度的伴隨E-cadherin下調、Vimentin上調的EMT，促進其侵襲轉移等惡性進展。另外，有報道EMT在促進VM的形成過程發揮重要作用[14]，本結果中VM與EMT標志蛋白E-cadherin、Vimentin的表達具有負、正相關性與之相符，推測CSCC中可能也存在這一進展機制。

更有研究發現，缺氧及缺氧導致的HIF-1α可通過誘導腫瘤中伴隨E-cadherin下調、Vimentin上調的EMT過程，促進VM的形成，促進腫瘤的侵襲和遷移[15]。我們的研究結果中， VM、HIF-1α及EMT標志蛋白(E-cadherin和Vimentin)表達分別相關，其表達均隨著分化程度的降低、淋巴結的轉移而發生相應變化；加之同一標本的表達定位觀察發現，VM陽性患者有56.2%HIF-1α陽性時伴隨著E-cadherin陰性表達、Vimentin陽性表達，VM陰性者HIF-1α陽性時不存在這樣的對應關系。推斷CSCC中可能也存在上述機制，協同促進其侵襲轉移。另外，我們還發現HIF-1α在CSCC組織的陽性率較高為60.5%，而VM、E-cadherin、Vimentin陽性率分別為37.2%、37.2%、32.6%。結合相關文獻[16,17]推斷，腫瘤快速生長形成的缺氧微環境可能刺激大量鱗癌細胞HIF-1α過表達，但僅部分具有多能胚胎樣干細胞基因型的細胞通過過表達的HIF-1α調控EMT的發生，進而使腫瘤細胞去分化為腫瘤干細胞樣細胞，然后模仿內皮細胞樣形態，其間伴隨著一系列復雜的變化，最終連通于宿主血管形成VM，促進腫瘤的侵襲轉移等惡性進展的出現。

總之，VM、HIF-1α及EMT均在CSCC的發展、侵襲轉移過程發揮重要作用，其聯合檢測對高度侵襲性、高度惡性CSCC的診斷具有一定的指導意義。HIF-1α可能通過下調E-cadherin、上調Vimentin誘導EMT，促進VM的形成，可能成為CSCC治療中配合抑制血管生成的新靶標，但其具體機制十分復雜且相互交鎖，仍待更進一步研究。

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王振國(E-mail: guozhen1963@163.com)

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B

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2016-05-13)