Oct4和 PI3K在胃癌組織中的表達變化及意義

程玉，薛晶，次云哲，紀海茹,鄭紀寧

(承德醫學院，河北承德067000)

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·臨床研究·

Oct4和 PI3K在胃癌組織中的表達變化及意義

程玉，薛晶，次云哲，紀海茹,鄭紀寧

(承德醫學院，河北承德067000)

目的觀察八聚體結合轉錄因子(Oct4)與磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)在胃癌組織中的表達變化，并探討其臨床意義。方法 收集60例胃癌組織和25例正常胃組織，分別應用Western blot和RT-PCR法檢測Oct4與PI3K蛋白和mRNA；分析Oct4、PI3K表達與胃癌臨床病理特征的關系，以及胃癌組織中Oct4與PI3K表達的關系。結果 Oct4、PI3K蛋白和mRNA在胃癌組織中的相對表達量均高于在正常胃組織(P均<0.01)。胃癌組織分化程度越低、浸潤深度越深、有淋巴結轉移的胃癌組織中，Oct4、PI3K蛋白及mRNA相對表達量越高(P均<0.05)。相關性分析顯示，胃癌組織中Oct4、PI3K蛋白、mRNA表達呈正相關關系(r=0.634、0.587,P均<0.05)。結論 Oct4、PI3K從基因和蛋白水平在胃癌組織中呈高表達，二者共同參與了胃癌的發生、發展。

胃癌；八聚體結合轉錄因子；磷脂酰肌醇3-激酶

近年來，胃癌在我國的發病率和病死率均呈上升趨勢，因此胃癌的發生發展機制成為了研究的熱點。八聚體結合轉錄因子4蛋白(Oct4)是腫瘤干細胞的重要標志物之一[1]，對細胞的正常分化起著決定性作用[2]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路的活化可促進細胞增殖，并促進腫瘤細胞的轉移和侵襲[3]。PI3K是存在于細胞質的復合體，是磷脂激酶家族中的重要成員，在PI3K/Akt信號傳導通路中是始動因子[4]。目前，對于在胃癌的發生、發展中Oct4和PI3K信號轉導通路作用的研究報道較少。本研究檢測了正常胃組織與胃癌組織中Oct4、PI3K的表達，分析二者與胃癌患者臨床病理特征的關系，從而探索胃癌的發生、發展機制，也為臨床治療胃癌提供潛在作用靶點。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源收集承德醫學院附屬醫院2013年7月～2014年2月手術切除的胃癌組織60例及癌旁正常胃組織25例，患者術前均未行化療、放療，術后均經病理學檢查證實為胃腺癌，相應癌旁組織均未見累及。患者中男45例、女15例，年齡(56±10.47)歲；病理組織高、中分化24例，低分化36例；癌組織侵及漿膜層48例，未侵及漿膜層12例；無淋巴結轉移25例，有淋巴結轉移35例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期32例。所有標本離體后30 min內儲存在-80 ℃冰箱里，另一部分離體后立即于4%甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋。

1.1.2主要試劑兔抗人一抗Oct4及PI3K抗體均購自英國ABCOM公司，RIPA組織裂解液(BB120031)購自上海貝博公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、羊抗兔HRP標記二抗及ECL超敏發光液均購自北京索萊寶科技有限公司。cDNA合成試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，DNA Ladder試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。TRIzol 購自Invitrogen公司，引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成。Oct4上游引物為5′- GTGCCGTGAAGCTGGAGAA-3′，下游引物5′-TGGTCGTTTGGCTGAATACCTT-3′；PI3K上游引物5′- TGCTATGCCTGCTCTGTAGTGGT-3′，下游引物5′-GTGTGACATTGAGG-GAGTCGTTG-3′;β-actin上游引物5′-AGCGGGAAA-TCGTGCGTGAC-3′，下游引物5′-ACATCTGCTGGAA-GGTGGAC-3′。

1.2檢測方法

1.2.1Oct4、PI3K蛋白檢測采用Western blot法。稱取適量胃癌組織及遠端正常胃組織標本(50～100 mg)，剪碎，加入約600 μL RIPA蛋白裂解液和5 μL PMSF蛋白保護液；4 ℃下12 000 r/min離心20 min后取上清，測定其中蛋白濃度。灌制5%的濃縮膠和12%的分離膠，每泳道加總蛋白量80 μg進行電泳分離；在穩流狀態下低溫轉膜，將蛋白轉至PVDF膜，在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中常溫封閉3 h。分別加入兔抗人Oct4及PI3K單克隆抗體(1∶10 000)和小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。10 min×3次TBST洗膜后加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶10 000)和HRP標記的山羊抗鼠二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h。10 min×3次TBST洗膜后，顯影，定影。采用IPP圖像分析軟件，分別用Oct4、PI3K與β-actin灰度比值表示Oct4及PI3K蛋白相對表達量。

1.2.2Oct4、PI3K基因檢測采用RT-PCR法。按TRIzol說明書分別提取胃癌及正常胃組織總RNA，分別分析其完整性、濃度和純度。采用逆轉錄試劑盒進行RT-PCR檢測，PCR擴增產物經電泳進行定量檢測。采用IPP圖像分析軟件分析，分別用目的基因與內參β-actin灰度比值表示目的基因相對表達量。

2　結果

2.1胃癌與正常胃組織Oct4、PI3K蛋白表達比較見表1。

表1　　　　胃癌與正常胃組織Oct4、PI3K蛋白相對表達量比較±s)

注：與正常胃組織比較，*P<0.01。

2.2Oct4、PI3K蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系Oct4、PI3K蛋白表達與胃癌的分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移情況均有關(P均<0.05)。見表2。

2.3胃癌與正常胃組織Oct4、PI3K mRNA表達比較見表3。

2.4Oct4、PI3K mRNA表達與胃癌臨床病理特征的關系Oct4、PI3K mRNA的表達與胃癌的分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移情況均有關(P均<0.05)。見表4。

2.5胃癌組織中Oct4、PI3K表達的關系 相關性分析顯示，胃癌組織中Oct4與PI3K蛋白表達呈正相關關系(r=0.634,P<0.05)，Oct4與PI3K mRNA表達呈正相關關系(r=0.587,P<0.05)。

表2　　　　Oct4、PI3K蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系

表3　　　　胃癌與正常胃組織Oct4、PI3K mRNA相對表達量比較

注：與正常胃組織比較，*P<0.01。

表4　　　　Oct4、PI3K mRNA表達與胃癌臨床病理特征的關系

3　討論

Oct4 基因是八聚體核苷酸結合蛋白轉錄因子家族中的一員，早期發現于胚胎干細胞中[5,6]。人的Oct4蛋白屬于八聚體核苷酸結合蛋白家族第5類轉錄因子，它在調節胚胎發育、維持胚胎干細胞自我更新能力及定向分化能力方面具有重要作用[7]。除在胚胎和生殖細胞癌中表達外[8]，有研究者在乳腺癌MCF7細胞、肝癌Mahlava細胞和宮頸癌Hela細胞等非生殖細胞及組織腫瘤中也發現了Oct4的表達[9～12]。本研究發現,胃癌組織分化程度越低，Oct4的蛋白及mRNA相對表達量越高，且在浸潤深度侵及漿膜的胃癌組織中的表達高于于未侵及漿膜的胃癌組織，在有淋巴結轉移的胃癌組織中的相對表達量高于無淋巴結轉移的組織。這些實驗結果表明，隨著胃癌惡性程度的增加，Oct4表達也是增高的。Oct4的高表達可能是胃癌干細胞擴散的必須條件[13]。

PI3K是PI3K/Akt信號轉導通路的始動因子，此信號通路是一條酪氨酸激酶級聯信號通路。Src、Ras、Rac、Ab1、v-Crk等具有酪氨酸激酶活性的癌性蛋白可與PI3K的調節亞基p85結合而發生作用，這些癌性蛋白的異常活化可被PI3K持續活化，引起細胞形態改變、凋亡受阻，導致細胞轉化及過度增殖[14]。PI3K還可以將具有PH結構域的信號分子Akt招募到質膜上進行活化，活化的Akt進一步激活下游信號分子，對細胞功能進行調控[15]。本研究結果顯示，PI3K在胃癌組織中的表達明顯高于遠端正常組織，且隨著胃癌分化程度高、中、低變化，浸潤深度由淺到深的改變，PI3K表達增高，有淋巴結轉移者PI3K表達也明顯高于無淋巴結轉移者，提示PI3K激活與胃癌的發生發展及浸潤轉移有關。其機制可能是PI3K/Akt信號轉導通路在抵抗Fas調節的凋亡中起重要作用[16]。活化的PI3K/Akt信號轉導通路可以上調基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9 mRNA和蛋白的表達，降解細胞外基質，突破基底膜，促進侵襲浸潤[17]。

綜上所述，本研究從基因和蛋白水平證實了Oct4、PI3K在胃癌組織中高表達，并且二者的表達在胃癌組織中呈正相關，二者可能共同參與了胃癌的發生發展，但目前對于腫瘤中OCT4與PI3K相互作用的具體機制，還有待于進一步研究。

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