WTX與NME1在結直腸癌組織中的表達變化及其關系探討

陳文靜，徐家輝，徐陽微，張慶玲，2

(1 南方醫科大學南方醫院，廣州510515；2南方醫科大學基礎醫學院)

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WTX與NME1在結直腸癌組織中的表達變化及其關系探討

陳文靜1,2，徐家輝1，徐陽微1，張慶玲1，2

(1 南方醫科大學南方醫院，廣州510515；2南方醫科大學基礎醫學院)

目的觀察X染色體上的腎母細胞瘤基因(WTX)與轉移性基因23-H1(NME1)在結直腸癌組織中的表達變化，并分析二者的關系。方法 收集新鮮結直腸癌及配對的癌旁正常結直腸組織各20例，采用qRT-PCR及免疫組化法分別檢測WTX和NME1 mRNA及蛋白，分析二者表達的相關性；取人結直腸癌細胞株SW480、HCT116，采用免疫共沉淀法判定二者是否存在相互結合作用。結果 WTX基因在正常結直腸組織中相對表達量為5.917±3.580，明顯高于結直腸癌組織中的表達(0.785±0.238)，差異均具有統計學意義(t=6.367，P=0.000)。NME1基因在正常結直腸組織中相對表達量為2.862±1.181，明顯高于結直腸癌組織中的表達(0.810±0.296)，差異均具有統計學意義(t=7.236，P=0.000)。WTX與NME1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率分別為15%、10%，明顯低于癌旁正常結直腸組織的75%、70%(χ2=14.545，P=0.000；χ2=6.696，P=0.019)。在結直腸癌組織中，WTX和NME1蛋白表達呈正相關(r=0.793，P=0.000)。在SW480、HCT116細胞中，WTX抗體不能將NME1沉淀下來，NME1抗體也不能將WTX沉淀下來。結論 WTX與NME1表達缺失與結直腸癌的發生相關，二者表達呈明顯的正相關，但無相互結合作用。

結直腸癌；X染色體上的腎母細胞瘤基因；轉移性基因23-H1；免疫共沉淀；相互作用

結直腸癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，在西方國家的發病率和病死率位居所有腫瘤的第3位，嚴重威脅人們的健康[1,2]。然而，結直腸癌發生及發展的具體機制仍不清楚，尋找與其發生相關的腫瘤標志物具有重要意義。X染色體上的腎母細胞瘤基因(WTX)是首個被發現定位于X染色體上的抑癌基因，轉移性基因23-H1(NME1)也是一種腫瘤抑制基因。目前研究表明，WTX與NME1基因的缺失或突變與多種惡性腫瘤的發生及發展密切相關[3～12]，但二者表達與結直腸癌發生的關系尚不清楚。2013年12月～2014年12月,我們觀察了WTX與NME1在結直腸癌組織中的表達變化，并分析二者的關系。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1組織標本收集南方醫院同期切除的結直腸癌患者手術標本，包括癌及癌旁正常組織(距癌組織10 cm的正常結直腸黏膜組織)各20例。新鮮標本置于-80 ℃冰箱保存，其余部分標本以4%甲醛固定，脫水脫蠟制成組織蠟塊，室溫保存。

1.1.2細胞來源人結直腸癌細胞株SW480、HCT116為南方醫科大學病理實驗室自存。

1.1.3生物試劑RPMI 1640培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自BI公司；WTX抗體為本課題組制備，NME1抗體購自Abcam公司，HRP標記的山羊抗鼠/兔二抗、RIPA全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、5×SDS蛋白上樣緩沖液、化學發光液購自弗德公司；PVDF膜購自Millipore公司，蛋白A/G瓊脂糖購自Santa Cruz公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Bioworld公司，TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑來自TaKaRa試劑公司。免疫組化試劑盒購買自北京中杉金橋公司，熒光定量PCR引物購自英濰捷基公司。

1.2實驗方法

1.2.1WTX與NME1基因檢測采用qRT-PCR法。①組織總RNA提取：取綠豆大小的組織，以TRIzol裂解提取RNA，并檢測RNA濃度。②逆轉錄反應：按照TaKaRa逆轉錄的試劑盒說明書冰上進行操作，混勻配制反應體系；在37 ℃反應約15 min，85 ℃滅活約5 s，將所得反轉錄的產物置于-20 ℃保存，備用。③熒光定量PCR反應：使用Primer 5.0軟件設計引物，WTX上游引物5′-GACCCAAAAGG-ATGAAGCT-3′，下游引物 5′-CCCCTCCAAAGAAACTAGGC-3′；NME1上游引物5′-TTAATCAGATGGTCGGGGAT-3′，下游引物5′- GATCTATGAATGACAGGAGG-3′；GAPDH上游引物5′-ACAGCCCGCAGGATCAGGAAA-3′，下游引物5′-AACACGCTTCACGGGCACTC-3′。按照TaKaRa RT-PCR試劑盒的說明書配制反應體系，反應條件為95 ℃預變性約10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，共40個循環。以2-ΔΔCt來表示目的基因相對表達量，實驗重復3次。

1.2.2WTX與NME1蛋白檢測采用免疫組化法。以2 μm厚切片，65 ℃烤片6 h;二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水,流水沖洗后浸泡于PBS中；抗原修復后行山羊血清封閉，滴加適當比例稀釋的抗體37 ℃孵育2 h(鼠抗人NME1抗體1∶100，兔抗人WTX抗體1∶25)。PBS沖洗后滴加生物素標記的通用鼠/兔二抗，室溫孵育30 min；PBS沖洗后行DAB顯色劑顯色，蘇木素中室溫染色，中性樹膠封片。陽性細胞定位于腸上皮細胞及間質細胞，呈棕黃色。染色強度無色、淡黃色、黃色、棕黃色分別計0、1、2、3分，陽性細胞百分比﹤1%、1%～﹤25%、25%～﹤50%、50%～﹤75%、≥75%分別計0、1、2、3、4分。兩項得分相加0～3分定義為陰性，4～7分定義為陽性。

1.2.3WTX與NME1蛋白相互作用觀察采用免疫共沉淀法。將SW480、HCT116細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養。①細胞蛋白抽提：收集生長狀態良好的SW480及HCT116，加入預冷的用于IP的溫和裂解液RIPA Buffer，并按每1 mL RIPA Buffer加入10 μL磷酸酶抑制劑，1 μL蛋白酶抑制劑和5 μL 100 mmol/L PMSF；用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。②免疫共沉淀WTX或NME1相關蛋白：取30 μL全蛋白做Input(陽性對照組)，剩下的蛋白每1 mL總蛋白加入20 μL 蛋白A/G瓊脂糖原液以去除非特異性；剩余的蛋白平分為兩組，分別為實驗組及陰性對照組。在實驗組中按照2 μg WTX/NME1抗體∶1 000 μL總蛋白加入WTX/NME1抗體；在陰性對照組中按照2 μg IgG∶1 000 μL總蛋白加入IgG抗體；緩慢翻轉抗原抗體混合物4 ℃過夜；加入蛋白A/G瓊脂糖30 μL捕捉抗原抗體復合物，4 ℃緩慢翻轉抗6 h；收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，PBS洗5遍；2×上樣緩沖液40 μL將瓊脂糖-抗原抗體復合物懸起，混勻；上樣樣品煮沸5 min游離抗原、抗體、瓊脂糖，14 000 r/min瞬時離心5 s，將上清電泳，其余凍存于-80 ℃。③Western blot檢測：蛋白樣品經過10%SDS-PAGE電泳，再電轉至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃冰箱內孵育一抗過夜：anti-WTX(稀釋體積比1∶100)及anti-NME1(稀釋體積比1∶1 000)過夜；PBST洗5 min×5次，二抗(稀釋比例為1∶5 000)室溫孵育1 h。PBST洗5 min×5次；ECL發光液孵育后置于UVP成像系統成像。實驗重復3次。如果WTX及NME1抗體能分別將NME1及WTX蛋白沉淀，表示二者存在相互結合作用；如果不能，表示二者不存在相互結合的關系。

1.3統計學方法采用SPSS20.0統計軟件。qRT-PCR結果采用配對樣本t檢驗，免疫組化結果中樣本率的比較采用χ2檢驗，兩樣本的相關性分析采用Spearman相關性分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1結直腸癌及癌旁正常組織中WTX及NME1基因相對表達量比較qRT-PCR檢測結果顯示，WTX基因在正常結直腸組織中相對表達量為5.917±3.580，明顯高于結直腸癌組織中的表達(0.785±0.238)，差異具有統計學意義(t=6.367，P=0.000)。NME1基因在正常結直腸組織中相對表達量為2.862±1.181，也明顯高于結直腸癌組織中的表達(0.810±0.296)，差異具有統計學意義(t=7.236，P=0.000)。

2.2結直腸癌及癌旁正常組織中WTX及NME1蛋白比較及其相關性WTX在結直腸癌組織中的陽性表達率為15%，明顯低于癌旁正常組織的75%(χ2=14.545，P=0.000)。NME1在結直腸癌組織中的陽性表達率為10%，也明顯低于癌旁正常結直腸組織的70%(χ2=6.696，P=0.019)。WTX和NME1在結直腸癌組織中的表達呈正相關(r=0.793，P=0.000)，而其在正常結直腸組織中的表達無明顯相關關系(r=0.126，P=0.597)。

2.3結直腸癌細胞中WTX及NME1的作用關系結果表明，WTX抗體并不能將NME1沉淀下來，NME1抗體也不能將WTX沉淀下來，提示WTX與NME1無相互結合作用。

3　討論

WTX及NME1均為腫瘤抑制基因，目前的研究均表明其與多種惡性腫瘤的發生及發展密切相關[3～6, 9～12]。其中，WTX是首個被發現定位于X染色體上的抑癌基因，全長3 405 bp，在胃癌、肝癌中均表達缺失，其作用機制與p53及Wnt/β-catenin信號通路有關[5, 7, 13]。NME1是核苷二磷酸激酶家族蛋白成員之一，位于17q21.3，參與多種生物學進程，如腫瘤細胞的黏附、生長及侵襲，其發揮作用的機制主要涉及Akt、MAPK/Erk1/2及NF-κB等信號通路[14]。然而，關于WTX及NME1在結直腸癌組織中的表達情況目前尚未見報道，其表達是否參與結直腸癌的發生也尚不明確。為了明確WTX及NME1表達與結直腸癌發生的關系，我們進行了本研究。

注：A為以WTX抗體免疫沉淀NME1；B為以NME1抗體免疫沉淀WTX。

圖1免疫共沉淀檢測WTX與NME1的結合關系

在本研究中，我們首先通過qRT-PCR檢測了20例配對結直腸癌及癌旁正常組織中WTX及NME1在基因水平的表達情況，結果顯示WTX及NME1基因在結直腸癌組織中的表達明顯低于癌旁正常結直腸組織。提示WTX及NME1在結直腸癌組織中存在著轉錄水平的表達缺失，其表達的缺失可能與結直腸癌的發生相關。隨后，我們也通過免疫組化檢測了20對配對結直腸癌及癌旁正常結直腸組織中WTX及NME1蛋白水平的表達情況，結果顯示WTX與NME1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率均明顯低于癌旁正常結直腸組織。提示WTX及NME1在結直腸癌組織中也存在著蛋白水平的表達缺失。qRT-PCR及免疫組化的結果一致，表明WTX及NME1表達的缺失與結直腸癌的發生相關。

同時，我們發現WTX和NME1在結直腸癌組織中的表達呈明顯的正相關，可能由于樣本量小的原因，在正常組織中并沒有發現WTX和NME1的相關性。為此，我們推測WTX和NME1可能存在著相互結合，發揮協同作用，共同參與結直腸癌的發生。為了探討NME1與WTX是否存在著相互結合，我們進行了免疫共沉淀實驗。免疫共沉淀法是非常有效的篩選蛋白復合物的實驗，可真實反映正常生理條件下蛋白質間的相互作用。該技術既可用來驗證已知蛋白間的相互作用，又可用于驗證已知蛋白與未知蛋白間的相互作用[15]。然而，免疫共沉淀結果顯示，在兩種人結直腸癌細胞株中，WTX抗體不能將NME1沉淀下來，NME1抗體也不能將WTX沉淀下來。提示WTX與NME1并不能直接形成蛋白復合物發揮作用，二者可能是通過不同的分子機制參與調控結直腸癌的發生。

綜上所述，WTX與NME1表達缺失與結直腸癌的發生相關，其表達呈正相關，但二者無相互結合作用。WTX與NME1可能為結直腸癌早期診斷及篩查的潛在靶點，其表達的檢測具有重要的臨床意義。當然，由于本研究納入的樣本量較小，具有一定的局限性，因此，仍需要后續實驗研究的證實。

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Expression and correlation between WTX and NME1 in colorectal cancer tissues

CHENWenjing1,XUJiahui,XUYangwei,ZHANGQingling

(1NanfangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

ObjectiveTo observe the expression changes of WTX and NME1 in chromosome X of colorectal cancer tissues and to analyze the correlation between them. MethodsThe mRNA and protein expression and correlation between WTX and NME1 was analyzed in 20 cases of human colorectal cancer and matched adjacent normal colorectal tissues by qRT-PCR and immunohistochemistry, respectively. Then, the colorectal cancer cell lines SW480 and HCT116 were selected to detect whether there was interaction between WTX and NME1 by co-immunoprecipitation assay. Results The expression of WTX in normal colorectal tissues was 5.917±3.580, which was significantly higher than that (0.785±0.238) in the matched colorectal cancer with a significant difference (t=6.367,P=0.000). The relative expression of NME1 in normal colorectal tissues was 2.862±1.181, which was significantly higher than that (0.810±0.296) in matched colorectal cancer with a significant difference (t=7.236,P=0.000). The positive expression rate of WTX in colorectal cancer was 15%, which was significantly lower than that in adjacent normal colorectal tissues (75%,P=0.000). The positive expression rate of NME1 in colorectal cancer was 10%, which was significantly lower than that in the adjacent normal colorectal tissues (70%,P=0.019). Meanwhile, WTX was positively correlated with NME1 in colorectal cancer (r=0.793,P=0.000). However, co-immunoprecipitation assay showed WTX did not directly interacted with NME1. ConclusionWTX and NME1 depletion is related to the occurrence of colorectal cancer, and they present positive correlation but do not have interacted binding effect.

colorectal carcinoma; WTX gene; neoplasm metastasis23 H1; co-immunoprecipitation; interaction

國家自然科學基金資助項目(81272760，81071989)。

陳文靜(1989-)，女，在讀碩士，主要研究方向為結直腸癌轉移的分子機制。E-mail： 570461152@qq.com

簡介：張慶玲(1970-)，女，教授，主要研究方向為胃腸腫瘤發生發展的分子機制。E-mail： zqllc8@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.002

R735.3

A

1002-266X(2016)34-0004-04

2016-04-15)