丙型肝炎病毒核心抗原酶標(biāo)抗體的制備及ELISA檢測方法的建立

劉 旭，譚柏清，王 進(jìn)

（1.山東恒信檢測技術(shù)開發(fā)中心；2.山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，濟(jì)南 250200）

丙型肝炎病毒核心抗原酶標(biāo)抗體的制備及ELISA檢測方法的建立

劉 旭1，譚柏清2，王 進(jìn)2

（1.山東恒信檢測技術(shù)開發(fā)中心；2.山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，濟(jì)南 250200）

將抗丙型肝炎病毒核心抗原抗體（Anti-HCV Core protein）應(yīng)用過碘酸鈉法標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP），制備抗丙型肝炎病毒核心抗原酶標(biāo)抗體，根據(jù)酶聯(lián)免疫操作步驟，應(yīng)用美國Ortho公司試劑盒的其它組分，建立一種丙型肝炎病毒核心抗原雙抗夾心檢測法，并對比市場上的試劑盒進(jìn)行檢測。

丙型肝炎病毒核心抗原；辣根過氧化物酶；標(biāo)記；臨床

0 引言

丙型病毒性肝炎，簡稱為丙型肝炎、丙肝，是一種由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎，主要經(jīng)輸血、針刺、吸毒等傳播。

本實驗通過用辣根過氧化物酶（HRP），對抗丙肝核心抗原抗體進(jìn)行標(biāo)記，利用美國ortho公司成品試劑盒的其他組分，組裝形成丙型肝炎核心抗原檢測試劑盒，驗證自制試劑盒的準(zhǔn)確性、特異性以及與ortho公司產(chǎn)品的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）實驗試劑。辣根過氧化物酶（sigma）；過碘酸鈉（百靈威科技有限公司）；抗HCV-cΑg單克隆抗體（美國賽萊克斯cellex公司）；丙型肝炎核心抗原檢測試劑盒（美國0rtho公司）；0.2mol/L，pH5.6醋酸鹽緩沖液；0.01mol/L，pH7.4 磷酸鹽緩沖液；1.0mol/L， pH9.5 碳酸鹽緩沖液。（2）主要儀器。BIOBΑSE8001全自動酶免工作站，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；BIOBΑSE洗板機(jī)，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；DHP-260恒溫培養(yǎng)箱，常州中捷實驗儀器制造有限公司；微孔板恒溫振蕩器，上海島韓實業(yè)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，中科中佳 HC-3018R。

1.2 實驗方法

（1）試劑盒的應(yīng)用及檢測實際操作。（2）樣品排布。利用自產(chǎn)的試劑盒與美國ortho公司的對照，檢測臨床42個樣本，對陰陽性符合率進(jìn)行驗證。每個樣本先用ortho公司的檢測。（3）試劑盒的特異性。選取臨床上的病理樣本，分別為27例類風(fēng)濕因子（RF）陽性樣本，25例免疫球蛋白陽性樣本，18例自身抗體陽性樣本（上述樣本抗HCV和HCV均為陰性），用自配制的酶標(biāo)抗體和ortho公司的酶標(biāo)抗體各檢測一次，驗證試劑盒的特異性。（4）相關(guān)性。選擇臨床上丙型肝炎病毒核心抗原強(qiáng)陽性樣本，對該樣本進(jìn)行等比稀釋。

分別利用自制試劑盒與Ortho試劑盒對每個樣本重復(fù)進(jìn)行兩次檢測，獲得其吸光強(qiáng)度，比對兩個試劑盒的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

（1） 試劑盒準(zhǔn)確度分析。通過對42個樣本進(jìn)行檢測，其96孔板顯色程度所示。通過樣本檢測顯色結(jié)果顯示，美國ortho公司的試劑盒顯色強(qiáng)度要比自制試劑顯色強(qiáng)度要高，但是陰陽性檢測結(jié)果是完全一致的，即該42個樣本中，有8個陽性樣本，兩試劑盒檢測均為陽性，其他樣本兩試劑盒檢測均為陰性，陰陽性符合率為100%。通過該檢測結(jié)果，自制的酶標(biāo)抗體，結(jié)合美國ortho公司其他試劑盒組分，組成的自制丙型肝炎病毒核心抗原檢測試劑盒與對照試劑盒準(zhǔn)確度一致，顯色強(qiáng)度低說明酶標(biāo)抗體的濃度與對照試劑盒相比偏低，但是對試劑盒檢測沒有影響，而且還可以節(jié)省試劑盒成本。

（2）試劑盒特異性分析。利用兩個試劑盒對27例類風(fēng)濕因子（RF）陽性樣本，25例免疫球蛋白陽性樣本，18例自身抗體陽性樣本（上述樣本抗HCV和HCV均為陰性），進(jìn)行檢測結(jié)果如表1所示。通過以上對于70例病理陽性樣本的檢測，自制丙型肝炎病毒核心抗原檢測試劑盒的特異性較美國ortho公司的成品試劑盒有微弱差異，25例免疫球蛋白陽性樣本中，自產(chǎn)試劑盒檢測有1例為陽性，因此免疫球蛋白會對自產(chǎn)試劑盒存在干擾，該原因主要是購買的抗體沒有經(jīng)過純化，可能存在非特異性結(jié)合。檢測抗干擾能力為98.5%，比成品試劑盒較差，但是完全可以滿足臨床要求。

表1 對70例病理陽性樣本檢測結(jié)果

（3）線性相關(guān)性檢測。通過BIOBΑSE8001全自動酶免工作站對顯色強(qiáng)度進(jìn)行檢測，根據(jù)統(tǒng)計的吸光強(qiáng)度獲得線性關(guān)系如圖1所示。以美國ortho公司的檢測結(jié)果為橫坐標(biāo)，以自產(chǎn)試劑盒的檢測結(jié)果為縱坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸統(tǒng)計分析，得回歸方程為y=0.8878x+0.0007，r=0.9976， r＞0.990，可以認(rèn)為兩種方法具有極佳的相關(guān)性。

3 結(jié)論

通過過碘酸鈉方法，用辣根過氧化物酶對丙型肝炎病毒核心抗原的抗體進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合美國ortho公司的丙型肝炎病毒核心抗原檢測試劑盒的組分，組裝了自產(chǎn)的試劑盒，用以對丙型肝炎病毒核心抗原進(jìn)行檢測。通過對比美國ortho公司的試劑盒，進(jìn)行準(zhǔn)確度、特異性和相關(guān)性的分析，兩試劑盒檢測陰陽性符合率達(dá)到100%，抗干擾性為98.5%，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9976。該研究對國內(nèi)臨床對于丙型肝炎的檢測具有潛在的應(yīng)用價值。

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10.16640/j.cnki.37-1222/t.2016.19.224

劉旭（1985-），男，山東成武人，本科，助理工程師，研究方向：醫(yī)療器械。