飛蝗Argonaute1的分子特性及生物學功能

王艷麗，楊美玲，宋天琪，馬恩波，張建珍

（1山西大學應用生物學研究所，太原 030006；2山西大學生命科學學院，太原 030006；3中國科學院動物研究所，北京 100101）

飛蝗Argonaute1的分子特性及生物學功能

王艷麗1，2，楊美玲3，宋天琪1，馬恩波1，張建珍1

（1山西大學應用生物學研究所，太原 030006；2山西大學生命科學學院，太原 030006；3中國科學院動物研究所，北京 100101）

【目的】MicroRNAs（miRNAs）是一類長度約22 nt的非編碼RNA，通過轉錄后調控的方式在多種生命活動中發揮重要功能。Argonaute1（AGO1）蛋白作為miRNA沉默復合物（miRNA silencing complex RISC）的重要組成部分，在miRNA調控通路中起著關鍵作用。論文旨在研究AGO1的生物學功能及其對飛蝗（Locusta moratoria）生長發育的影響，為探索昆蟲miRNA的生物合成和農業害蟲的有效控制提供理論依據。【方法】采用生物信息學方法在飛蝗轉錄組數據庫中獲得LmAGO1 cDNA序列；使用在線蛋白翻譯軟件（ExPASy）對LmAGO1進行蛋白翻譯，利用SMART分析LmAGO1蛋白的功能結構域；選取家蠶（Bombyx mori）、果蠅（Drosophila melanogaster）和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）等模式昆蟲的同源序列與LmAGO1氨基酸序列進行聚類分析，采用Phyml軟件構建昆蟲AGO蛋白的系統發育樹；為了進一步研究LmAGO1在飛蝗生長發育過程中的作用，使用T7 RiboMAXTM Express RNAi System體外合成LmAGO1的dsRNA，在飛蝗4齡第2天和5齡第2天若蟲期連續兩次注射dsRNA進行干擾，同時注射dsGFP作為對照。分別收集注射dsRNA后48 h和72 h的整蟲樣品提取RNA，反轉錄為cDNA。通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測LmAGO1在不同時間點的干擾效率并觀察蟲體的發育表型。同時，為了檢測LmAGO1沉默是否會影響miRNA的生物合成，采用RT-qPCR對飛蝗體內5個高豐度miRNA表達進行定量分析。【結果】LmAGO1蛋白含845個氨基酸，具有典型的AGO蛋白家族保守結構域，即位于213—348位點的PAZ結構域和502—804位點的PIWI結構域。聚類分析表明，LmAGO1蛋白與其他昆蟲的AGO1蛋白聚為一類。通過AGO1氨基酸序列同源比對結果顯示LmAGO1與模式昆蟲果蠅、家蠶AGO1的氨基酸序列一致度高達82.2%和86.9%。RNAi結果表明，蟲體注射dsLmAGO1 48 h和72 h后，與對照組相比，LmAGO1表達量均顯著降低，干擾效率分別為88.1%和93.0%；進一步觀察試蟲生長發育的表型特征，與對照組相比，飛蝗4齡期注射dsLmAGO1后其生長發育并沒有出現明顯異常，待蛻皮發育至下一齡期（即5齡期）時，出現大量死亡，死亡率為89.3%；熒光定量PCR結果顯示注射dsLmAGO1 48 h后，飛蝗體內miRNA-252和miRNA-8的表達顯著下降，干擾72 h后miRNA-7、let 7、miRNA-252、miRNA-8的表達均顯著下降。【結論】飛蝗AGO1除參與RSIC的形成以外，還可能參與miRNA的剪切加工過程進而調控飛蝗的正常發育。

飛蝗；miRNA；Argonaute1；RNA干擾；生物學功能

0　引言

【研究意義】miRNA是存在于生物體內長約22 nt的內源性非編碼RNA，可以在轉錄后水平對靶基因進行調控。AGO1蛋白與miRNA相結合形成RISC，對靶標基因mRNA進行切割或抑制其翻譯［1］，從而影響靶基因的表達。飛蝗（Locusta migratoria）隸屬于直翅目，蝗總科，飛蝗屬，廣泛分布于歐洲、亞洲、非洲及澳洲等地，是重要的農業害蟲。目前蝗災防治策略主要采取農藥防治，但長期的化學防治已導致飛蝗抗藥性的產生和農業生態環境的破壞，因此亟需發展高效且對生態環境友好的防治策略。隨著分子生物學的發展，篩選分子靶標，利用RNA干擾技術控制害蟲的生長發育是農業植保領域新的發展方向。探索LmAGO1的生物學功能及對miRNA生物合成的影響，對于篩選分子靶標，開展害蟲綠色防控具有重要意義。【前人研究進展】miRNA的發現使傳統的“中心法則”得到補充與完善［2］。自1993年在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發現第一個miRNA-Lin4后，越來越多的研究表明miRNA在生物體的生命活動中具有重要意義，其參與調控生物體細胞分化、增殖、衰老、代謝、病毒防御、胚胎發育以及免疫應答等重要過程［3-4］。WEI等［5］首次使用高通量測序法對飛蝗小RNA進行鑒定，此工作極大推動了非模式昆蟲小RNA的研究。此后，筆者課題組對飛蝗多個組織及不同發育時期的小RNA進行系統性鑒定，發現基因組擴大對于小RNA的倍增起到關鍵作用［6］。miRNA在基因轉錄和轉錄后調控中起著重要的作用，進一步的深入研究表明miRNA可調控飛蝗的蛻皮發育及型變［7-8］。miRNA行使其調控功能需要與AGO蛋白形成RISC復合體來調控靶基因的表達。AGO蛋白是miRNA執行功能的重要因子，其一般定位于細胞質中，該蛋白首先在植物中被發現，其家族在進化上高度保守，其數量在不同物種具有差異，例如水稻（Oryza sativa）中有19個、擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有10個、人（Homo sapiens）中發現8個、家蠶（Bombyx mori）中發現4個、果蠅（Drosophila melanogaster）中存在5個［9-10］。AGO蛋白主要由4個部分組成，分別為N末端、PAZ（Piwi-Argonaute-Zwille）結構域、MID結構域和PIWI（P-element Induced Wimpy Testis）結構域。此外，在AGO蛋白中還有兩個負責連接N端PAZ結構域的Linker1（L1）以及連接PAZ和MID結構域的Linker2（L2）［11］。AGO蛋白是組成RISC復合物的主要成分，通過抑制或阻斷靶標基因的表達，參與基因的轉錄后水平調控［12-14］。DIEDERICHS等［15］研究發現在哺乳動物中AGO2具有核酸內切酶活性，通過剪切產生ac-pre-miRNA，并參與成熟體miRNA的合成過程，內源性AGO2蛋白的減少會降低ac-pre-miRNA乃至成熟體miRNA的形成。【本研究切入點】AGO蛋白不僅作為RISC復合物重要組分，也可作為核酸內切酶參與成熟體miRNA形成，這一功能僅在哺乳動物中有報道［15］。昆蟲中AGO蛋白是否也具有核酸內切酶的功能并參與成熟體miRNA形成目前尚不清楚，需要進行深入探索。【擬解決的關鍵問題】基于上述文獻結果，提出假設：飛蝗AGO1可能具有類似于哺乳動物核酸內切酶的生物學功能。因此，本文以飛蝗為研究對象，獲得飛蝗AGO1（LmAGO1）cDNA序列，采用RNA干擾技術沉默LmAGO1，檢測LmAGO1在不同時間點的沉默效率以及對飛蝗體內5個高豐度miRNA表達的影響，探索AGO1在miRNA合成中的作用以及對飛蝗生長發育的影響，為昆蟲miRNA的合成機制和新分子靶標篩選提供依據。

1　材料與方法

試驗于2014—2015年在中國科學院動物研究所完成。

1.1材料

供試飛蝗（2005年4月采自河北黃驊）為室內連續多代飼養。飼養條件：室溫（28—30）℃，相對濕度15%—25%，光周期14L∶10D；蟲體飼養在通風良好的木籠（25 cm×25 cm×25 cm）中，以麥苗和麥麩飼喂。

1.2LmAGO1結構功能域及分子進化分析

通過飛蝗轉錄組信息預測，得到LmAGO1的cDNA序列，使用在線蛋白翻譯軟件（ExPASy）對AGO1進行蛋白翻譯。使用蛋白保守結構域分析軟件SMART對LmAGO1蛋白功能結構域進行鑒定。使用GENEDOC軟件將LmAGO1蛋白與其對應的果蠅和家蠶同源AGO1蛋白進行多序列比對，并使用EMBOSS軟件包中的needle程序進行基于全局比對（Global alignment）策略的氨基酸序列相似度計算。根據LmAGO基因序列，運用NCBI的BLAST工具對AGO基因序列進行同源搜索和比對，下載來源于其他物種的同源序列，使用Phyml軟件中的最大似然法和JTT模型構建系統進化樹，進行1 000次bootstrap自舉檢驗。

1.3LmAGO1的干擾及熒光定量PCR檢測

1.3.1引物設計依據LmAGO1序列，利用Primer5.0軟件設計RNA干擾及熒光定量PCR（RT-qPCR）引物，文中所用引物如表1所示。

1.3.2LmAGO1雙鏈合成及RNA干擾使用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega）合成AGO1和GFP（綠色熒光蛋白基因）的雙鏈RNA［16］，經瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶單一且無降解產物，可以用作后續的干擾試驗。合成的雙鏈用無RNA酶的水稀釋到5 μg·μL-1，選擇飛蝗4齡第2天的若蟲，在其第2和第3腹節處用微量注射器注射10 μg dsRNA，待其發育至5齡第2天時，再注射一次等劑量的dsRNA。試驗組（dsLmAGO1）為28頭若蟲，對照組（dsGFP）為26頭若蟲。注射dsRNA后，每天觀察并記錄表型。

1.3.3RT-qPCR定量檢測收取整蟲樣本，用Trizol分別提取第一次干擾后48及72 h富含miRNA的總RNA，使用M-MLV Reverse Transcriptase（Promega）及Oligo（dT）-primed反轉錄cDNA，使用MiRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（天根）合成miRNA cDNA，每個處理組設置4個生物學重復。分別使用RealMaster Mix SYBR Green（天根）和MiRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（天根）對AGO1及miRNA進行熒光定量PCR檢測分析。運用2-??CT對定量數據進行處理，使用SPSS15.0數據統計軟件中的Independent samples T-test方法分析差異顯著性。

表1　LmAGO1 RNAi干擾雙鏈合成引物以及RT-qPCR定量引物Table 1　Primers used for AGO1 dsRNA synthesis and AGO1 RT-qPCR

2　結果

2.1LmAGO1結構域及其系統發育分析

對AGO1序列分析結果顯示LmAGO1蛋白含有845個氨基酸，使用SMART軟件預測該蛋白含有1個起止于153—205位點的DUF結構域和2個典型的保守結構域，分別為位于213—348 位點的PAZ結構域和502—804位點的PIWI結構域。這2個保守的結構域是AGO蛋白行使切割功能的活性中心（圖1-A）。

AGO1氨基酸序列同源比對結果顯示LmAGO1與DmAGO1、BmAGO1氨基酸序列的序列一致度較高，分別為82.2%和86.9%。比對結果顯示，LmAGO1與果蠅和家蠶的AGO1氨基酸序列均具有DUF結構域（黑色框區域）、PAZ結構域（紅色框區域）和PIWI結構域（藍色框區域）（圖1-B）。

系統發育分析結果顯示，AGO1和AGO2蛋白被明顯地分為兩支，在AGO1分支中，飛蝗與灰飛虱（Laodelphax striatella）、褐飛虱（Nilaparvata lugens）的親緣關系最近，并與家蠶、果蠅、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、秀麗隱桿線蟲聚為一簇，均聚為AGO1家族，表明所鑒定的飛蝗AGO蛋白屬于AGO1類型（圖1-C）。

2.2LmAGO1功能分析

利用熒光定量PCR技術檢測了RNAi AGO1后LmAGO1的干擾效率，發現LmAGO1在dsRNA注射后48 h和72 h的干擾效率均很高，分別達到88.1%和93.0%（圖2）。

進一步觀察了RNAi干擾AGO1后，飛蝗生長和發育的表型特征，發現飛蝗在4齡第2天注射dsRNA后的生長發育表型與對照組相比無明顯變化，但當其蛻至下一齡期（即5齡期）第3天時，飛蝗開始出現死亡，死亡率高達89.3%，而對照組的死亡率僅為11.2%（圖3）。

圖1　LmAGO1的功能結構域及系統進化分析Fig. 1　Domain organization and phylogenetic analysis of LmAGO1

圖2　熒光定量PCR分析LmAGO1的干擾效率Fig. 2　The silencing efficiency analysis of LmAGO1 by RT-qPCR

2.3LmAGO1基因干擾后miRNA的表達分析

為了證明AGO1沉默是否影響了miRNA的表達，選取5個飛蝗體內高豐度的miRNAs進行了熒光定量PCR檢測。發現AGO1基因干擾48 h后，被檢測的miRNAs中miRNA-252和miRNA-8的表達顯著下降（圖4-A）；干擾72 h后miRNA-7、let7、miRNA-252、miRNA-8的表達均顯著下降（圖4-B）。

3　討論

目前昆蟲中的AGO主要分為Argonaute和PIWI兩個家族［17］。AGO1和AGO2均屬于Argonaute家族，參與RISC復合物的加工。在昆蟲中AGO1主要負責miRNA介導的基因沉默，而AGO2主要負責siRNA介導的基因沉默［18-19］。通過系統進化分析，發現昆蟲AGO1成員之間在進化樹上的枝長較短，而AGO2成員之間的枝長較長。蛋白質序列的比對分析發現LmAGO1與DmAGO1、BmAGO1一致度分別為82.2%和86.9%，LmAGO2與DmAGO2、BmAGO2一致度分別為37.5%和29.5%。這些結果表明昆蟲中AGO1家族的基因序列分化程度較小，較AGO2家族更為保守。

圖3　AGO1 RNA干擾后對飛蝗發育的影響Fig. 3　The effect of LmAGO1 RNAi on locust development

圖4　熒光定量PCR分析AGO1基因干擾后miRNAs的表達情況Fig. 4　The expression of miRNAs after dsLmAGO1 injection by RT-qPCR

AGO1對飛蝗正常發育非常重要。本研究中4齡第2天注射dsLmAGO1進行RNA干擾后并未引起飛蝗死亡，但飛蝗蛻皮發育至5齡初期繼續注射dsLmAGO1后，飛蝗出現了大量死亡。在果蠅脂肪體中miR-8能夠調節抗菌肽Drosomycin和Diptericin進而維持免疫平衡［20］。miR-252能夠調節登革熱病毒包膜蛋白的表達，在白紋伊蚊（Aedes albopictus）起到細胞內抗病毒的作用［21］。因此，推測LmAGO1基因缺失后引起的大量死亡可能與其后續影響miRNA的合成有關，從而影響到飛蝗免疫穩態維持和病毒防御應答。由于AGO1基因缺失后對miRNA合成的影響具有時間效應，并不是即時發生的，當miRNA的量減少到一定程度時會影響飛蝗的正常發育，所以在AGO1被注射后，飛蝗蛻皮發育至下個齡期才引起大量死亡。已有研究發現AGO1缺失會顯著降低飛蝗Vg蛋白的轉錄和卵泡上皮的正常發育，從而影響卵母細胞成熟和卵巢的形成［22］。在果蠅中AGO1缺失后導致其卵母細胞和生殖細胞的形成和分化異常［23］，同時有文獻報道果蠅胚胎期缺乏AGO1會使其胚胎發育異常致死［24］。與AGO1密切相關的miRNAs的表達受到抑制后也會產生類似于AGO1缺失后的發育異常。抑制miR-184的表達同樣能夠使得果蠅早期胎發育異常［25］。在紅帶袖蝶（Heliconius melpomene）中，翅發育相關基因座HmYb中的兩個miRNA能夠控制翅的顏色形成及著色分布［26］。據此推測AGO1對昆蟲生長發育影響是多方面的，LmAGO1不僅可通過調控miRNA的表達影響若蟲期的發育，導致飛蝗大量死亡，同時也可能影響其卵期發育及成蟲期多個器官的發育。

LmAGO1被干擾后，一些高豐度表達的成熟體miRNAs的合成量顯著減少。研究結果顯示，被檢測的miRNAs表達與AGO1的表達呈正相關性，AGO1被沉默的時間越久，miRNAs表達下調的數量越多，表明AGO1在飛蝗miRNAs合成過程中起著重要作用，內源性AGO1表達下調抑制了成熟miRNA的合成與表達。DIEDERICHS等發現人的AGO2蛋白具有核酸內切酶的活性，可以將pre-miRNA剪切為ac-pre-miRNA，然后形成成熟體miRNA，AGO2突變后顯著抑制了成熟體miRNA的合成［15，27］，本研究結果與此一致。已有研究表明人的AGO1、AGO2均參與了miRNA通路的合成和加工［28］，人的AGO1是由AGO2基因倍增以后產生的，AGO2是更古老的參與miRNA加工的Argonaute家族成員［29］，因此推測昆蟲中參與miRNA合成的AGO1可能與人的AGO2是同源基因。本研究結果表明AGO1基因沉默后顯著影響了一些高豐度miRNA的合成，miRNA的合成紊亂導致其靶基因失調并影響蟲體的正常發育，推測飛蝗AGO1也可能與人類AGO2一樣具有核酸內切酶的活性。另一方面，AGO1的沉默可導致其蛋白量減少，影響了RISC復合體的形成以及miRNA的正常調控功能。這兩方面的原因都有可能導致沉默該基因后，飛蝗出現大量死亡的現象，但飛蝗致死是上述兩方面的原因共同影響還是單方面原因起主要作用，還需要今后的深入研究。

近年來，由于害蟲抗藥性的產生、殺蟲劑的殘留以及生物多樣性的不斷減少等原因，傳統的殺蟲劑已經不能滿足現代農業發展的需要，亟待開發綠色環保的新型殺蟲劑。LmAGO1蛋白作為miRNA行使功能的重要因子，在其生長發育過程中起著十分重要的作用，AGO1的缺失會導致飛蝗的大量死亡，因此利用RNAi技術將AGO1進行沉默可以為研發有效的生物環境友好型殺蟲劑提供重要的理論依據。

4　結論

通過對AGO1蛋白進行系統發育分析及對飛蝗基因組中的AGO1蛋白進行鑒定，研究了飛蝗與其他昆蟲AGO蛋白的系統進化關系；經體內注射dsRNA方法沉默飛蝗LmAGO1，發現干擾LmAGO1后可導致飛蝗死亡；進一步對AGO1生物學功能進行分析，明確了LmAGO1在miRNA合成與表達中的作用以及對飛蝗生長發育的影響。研究可為篩選新的分子靶標，開展基于RNA干擾的害蟲防治新技術體系提供理論與實踐依據。

References

［1］ CHENDRIMADA T P， GREGORY R I， KUMARASWAMY E，NORMAN J， COOCH N， NISHIKURA K， SHIEKHATTAR R. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. Nature， 2005， 436（7051）: 740-744.

［2］ AMBROS V. The evolution of our thinking about microRNAs. Nature Medicine， 2008， 14（10）: 1036-1040.

［3］ LIN H R， GANEM D. Viral microRNA target allows insight into the role of translation in governing microRNA target accessibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011， 108（13）: 5148-5153.

［4］ 劉仕平， 吳小燕， 張丹宇， 黃亞璽， 王偉， 趙萍， 夏慶友. 家蠶microRNA7靶基因Bmhairy的鑒定和轉錄表達模式. 中國農業科學， 2016， 49（1）: 195-204.

LIU S P， WU X Y， ZHANG D Y， HUANG Y X， WANG W， ZHAO P，XIA Q Y. Identification of Bmhairy as the target of bmo-miR-7 and its transcriptional expression profiles in the silkworm （Bombyx mori）. Scientia Agricultura Sinica， 2016， 49（1）: 195-204. （in Chinese）

［5］ WEI Y Y， CHEN S， YANG P C， MA Z Y， KANG L. Characterization and comparative profiling of the small RNA transcriptomes in two phases of locust. Genome Biology， 2009， 10（1）: R6.

［6］ WANG Y L， JIANG F， WANG H M， SONG T Q， WEI Y Y， YANG M

L， ZHANG J Z， KANG L. Evidence for the expression of abundant microRNAs in the locust genome. Scientific Reports， 2015， 5: 13608.

［7］ WANG Y L， YANG M L， JIANG F， ZHANG J Z， KANG L. MicroRNA-dependent development revealed by RNA interferencemediated gene silencing of LmDicer1 in the migratory locust. Insect Science， 2013， 20（1）: 53-60.

［8］ YANG M L， WEI Y Y， JIANG F， WANG Y L， GUO X J， HE J，KANG L. MicroRNA-133 inhibits behavioral aggregation bycontrolling dopamine synthesis in locusts. PLoS Genetics， 2014， 10（2）: e1004206.

［9］ HOCK J， MEISTER G. The Argonaute protein family. Genome Biology， 2008， 9（2）: Article 210.

［10］ WANG G H， JIANG L， ZHU L， CHENG T C， NIU W H， YAN Y F，XIA Q Y. Characterization of Argonaute family members in the silkworm， Bombyx mori. Insect Science， 2013， 20（1）: 78-91.

［11］ KUHN C D， JOSHUA-TOR L. Eukaryotic Argonautes come into focus. Trends in Biochemical Sciences， 2013， 38（5）: 263-271.

［12］ FERREIRA R， SANTOS T， AMAR A， GONG A， CHEN T C，TAHARA S M， GIANNOTTA S L， HOFMAN F M. Argonaute-2 promotes miR-18a entry in human brain endothelial cells. Journal of the American Heart Association， 2014， 3（3）: e000968.

［13］ GARCIA-RUIZ H， CARBONELL A， HOYER J S， FAHLGREN N，GILBERT K B， TAKEDA A， GIAMPETRUZZI A， GARCIA RUIZ M T， MCGINN M G， LOWERY N， MARTINEZ BALADEJO M T，CARRINGTON J C. Roles and programming of Arabidopsis ARGONAUTE proteins during Turnip mosaic virus infection. PLoS Pathogens， 2015， 11（3）: e1004755.

［14］ HUTVAGNER G， SIMARD M J. Argonaute proteins: key players in RNA silencing. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2008， 9（1）: 22-32.

［15］ DIEDERICHS S， HABER D A. Dual role for Argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell， 2007， 131（6）: 1097-1108.

［16］ 余志濤， 劉曉健， 馬恩波， 郭亞平， 張建珍. 中華稻蝗幾丁質合成酶1基因的mRNA表達及功能. 中國農業科學， 2012， 45（5）: 877-884.

YU Z T， LIU X J， MA E B， GUO Y P， ZHANG J Z. mRNA expression and physiological function of chitin synthase1 from Oxya chinensis（Thunberg）. Scientia Agricultura Sinica， 2012， 45（5）: 877-884. （in Chinese）

［17］ SASAKI T， SHIOHAMA A， MINOSHIMA S， SHIMIZU N. Identification of eight members of the Argonaute family in the human genome. Genomics， 2003， 82（3）: 323-330.

［18］ LUCAS K， RAIKHEL A S. Insect microRNAs: Biogenesis，expression profiling and biological functions. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2013， 43（1）: 24-38.

［19］ OKAMURA K， ISHIZUKA A， SIOMI H， SIOMI M C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes & Development， 2004， 18（14）: 1655-1666.

［20］ CHOI I K， HYUN S. Conserved microRNA miR-8 in fat body regulates innate immune homeostasis in Drosophila. Developmental and Comparative Immunology， 2012， 37（1）: 50-54.

［21］ YAN H， ZHOU Y， LIU Y， DENG Y， PUTHIYAKUNNON S， CHEN X. miR-252 of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus regulates dengue virus replication by suppressing the expression of the dengue virus envelope protein. Journal of Medical Virology， 2014， 86（8）: 1428-1436.

［22］ SONG J S， GUO W， JIANG F， KANG L， ZHOU S T. Argonaute 1 is indispensable for juvenile hormone mediated oogenesis in the migratory locust， Locusta migratoria. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2013， 43（9）: 879-887.

［23］ YANG J S， SMIBERT P， WESTHOLM J O， JEE D， MAURIN T， LAI E C. Intertwined pathways for Argonaute-mediated microRNA biogenesis in Drosophila. Nucleic Acids Research， 2014， 42（3）: 1987-2002.

［24］ KATAOKA Y， TAKEICHI M， UEMURA T. Developmental roles and molecular characterization of a Drosophila homologue of Arbidopsis Argonaute1， the founder of a novel gene superfamily. Genes to Cell，2001， 6（6）: 313-325.

［25］ IOVINO N， PANE A， GAUL U. miR-184 has multiple roles in Drosophila female germline development. Developmental Cell， 2009，17（1）: 123-133.

［26］ SURRIDGE A K， LOPEZ-GOMOLLON S， MOXON S， MAROJA L S， RATHJEN T， NADEAU N J， DALMAY T， JIGGINS C D. Characterisation and expression of microRNAs in developing wings of the neotropical butterfly Heliconius melpomene. BMC Genomic，2011， 12: 62.

［27］ YANG J S， LAI E C. Dicer-independent， Ago2-mediated microRNA biogenesis in vertebrates. Cell Cycle， 2010， 9（22）: 4455-4460.

［28］ WANG D， ZHANG Z， O'LOUGHLIN E， LEE T， HOUEL S，O'CARROLL D， TARAKHOVSKY A， AHN N G， YI R. Quantitative functions of Argonaute proteins in mammalian development. Genes & Development， 2012， 26（7）: 693-704.

［29］ MURPHY D， DANCIS B， BROWN J R. The evolution of core proteins involved in microRNA biogenesis. BMC Evolutionary Biology， 2008， 8: 92.

（責任編輯岳梅）

Molecular Characterization and Biological Function of Argonaute1 in Locusta migratoria

WANG Yan-li1，2， YANG Mei-ling3， SONG Tian-qi1， MA En-bo1， ZHANG Jian-zhen1
（1Research Institute of Applied Biology， Shanxi University， Taiyuan 030006；2College of Life Science， Shanxi University，Taiyuan 030006；3Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101）

【Objective】 MicroRNAs （miRNAs） are small （approximately 22 nt）， noncoding RNA molecules that play important roles through post-transcriptional regulation in a wide range of biological process. As an essential component ofmiRNA silencing complex （RISC）， Argonaute1 （AGO1） protein plays a key role in miRNA regulatory pathway. The purpose of this study is to explore the biological function of LmAGO1， and determine its impacts on growth and development in the migratory locust. These results will provide an important theoretical basis for biogenesis mechanism of insect miRNAs and effective pest control. 【Method】 The cDNA sequence of LmAGO1 was identified from the locust transcriptome database by using bioinformatics approaches， and was translated into protein sequence using online protein translation software （ExPASy）. The conserved domains were analyzed by SMART based on the deduced protein sequence. A phylogenetic tree of insect AGO was constructed with the locust AGO1， the homologous amino acid sequences from Bombyx mori， Drosophila melanogaster，Tribolium castaneum and other insects using the Phyml program. The double-strand RNAs （dsRNAs） of AGO1 gene were synthesized in vitro using T7 RiboMAXTMExpress RNAi System. The RNA interference （RNAi） experiment was preformed to explore the biological function of LmAGO1 during growth and development in locusts. The dsLmAGO1 was injected into the locust nymphs on day 2 of the 4th-instar and 5th-instar stages， respectively. The injection of dsGFP was used as the control. At the 48 h and 72 h after dsRNA injection， the whole body of locust nymphs was collected for total RNA isolation and cDNA synthesis. The reverse transcript quantitative PCR （RT-qPCR） analyses of the LmAGO1 were performed to determine the gene silencing efficiency. In order to evaluate the influences of the LmAGO1 RNAi on miRNA biogenesis， the five abundantly expressed miRNAs were selected to quantify their expression level by using RT-qPCR after dsLmAGO1 injection.【Result】 The amino acid analysis showed that LmAGO1 protein of locust contains 845 amino acids and has the typical AGO protein family conserved domains， including PAZ （Piwi-Argonaute-Zwille） domain which is located in the region from nucleotide 213 to 348 and PIWI （P-element Induced Wimpy Testis） domain which is located in the region from nucleotide 502 to 804. The phylogenetic analysis showed that LmAGO1 was clustered with the AGO1s of other insect species. The multiple protein sequence alignments indicated that the amino acid sequence identity is 82.2% between LmAGO1and DmAGO1， and is 86.9% between LmAGO1 and BmAGO1， respectively； RNAi results showed that the expression of LmAGO1 was significantly reduced at 48 h and 72 h after dsLmAGO1 injection into locust nymphs. The silencing efficiency of LmAGO1 was 88.1% and 93.0%， respectively. The locust nymphs with dsLmAGO1 treatment did not show any obvious phenotypic defects at the 4th-instar stage. However， compared with dsGFP injected control， the dsLmAGO1 treatment resulted in a high mortality at the 5th-instar stage. A total of 89.3% locust nymphs were dead in dsLmAGO1 injected group. The RT-qPCR results of LmAGO1 showed that LmAGO1 was significantly silenced at 48 h and 72 h after dsRNA injection. Moreover， the expression analysis of miRNA results indicated that the expression levels of miRNA-252 and miRNA-8 were significantly decreased at 48 h after dsLmAGO1 treatments， and that the expressions of miRNA-7， let-7， miRNA-252 and miRNA-8 were significantly down-regulated at 72 h after dsLmAGO1 treatments.【Conclusion】Besides the role in RSIC formation， LmAGO1 can enhance the processing of miRNA maturation and regulate the normal development in the migratory locust.

Locusta moratoria； miRNA； AGO1； RNAi； biological function

2016-05-23；接受日期：2016-08-05

國家自然科學基金（31472051，31272380）、山西省自然科學基金（2014011028-3）

聯系方式：王艷麗，E-mail：wangyanli110327@163.com。通信作者張建珍，E-mail：zjz@sxu.edu.cn