免移蟲(chóng)育王和兩種酯類幼蟲(chóng)信息素對(duì)中華蜜蜂蜂王質(zhì)量的影響

鄒垂彬，周林斌，胡景華，席芳貴，袁　芳，顏偉玉

（1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌 330045；2江西省養(yǎng)蜂研究所，南昌 330052）

免移蟲(chóng)育王和兩種酯類幼蟲(chóng)信息素對(duì)中華蜜蜂蜂王質(zhì)量的影響

鄒垂彬1，周林斌1，胡景華1，席芳貴2，袁芳2，顏偉玉1

（1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌 330045；2江西省養(yǎng)蜂研究所，南昌 330052）

【目的】比較中華蜜蜂（Apis cerana cerana）免移蟲(chóng)育王和人工移蟲(chóng)育王培育的蜂王質(zhì)量，明確幼蟲(chóng)信息素中的甲基棕櫚酸酯（methyl palmitate，MP）和甲基亞油酸酯（methyl linoleate，ML）在育王過(guò)程中能否提高蜂王質(zhì)量?！痉椒ā恳灾腥A蜜蜂為試驗(yàn)材料，選擇蜂群群勢(shì)、蜂王年齡、子脾面積等基本一致的健康蜂群3群作為哺育群，群勢(shì)均為5框，采用郎氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱飼養(yǎng)。另選擇一群健康、蜂王產(chǎn)卵性能好的蜂群作為母群。免移蟲(chóng)育王和人工育王的比較過(guò)程中，每個(gè)哺育群中每種育王方式至少育王3次。幼蟲(chóng)信息素試驗(yàn)過(guò)程中，每個(gè)哺育群每種信息素至少采用人工育王法育王3次。試驗(yàn)期間，對(duì)蜂群進(jìn)行獎(jiǎng)勵(lì)飼喂，提高工蜂哺育積極性。利用自主研制的塑料免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器進(jìn)行免移蟲(chóng)育王，人工移蟲(chóng)育王則采用自制的蠟質(zhì)王臺(tái)。測(cè)定育王過(guò)程中的幼蟲(chóng)接受率和蜂王出房率，待蜂王出房后測(cè)定蜂王初生重、胸重、胸寬，將蜂王的單側(cè)卵巢制成石蠟切片進(jìn)行卵巢管計(jì)數(shù)，并采用熒光定量PCR測(cè)定蜂王腹部的卵黃原蛋白基因（Vitellogenin，Vg）和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因（Transferrin，Trf）表達(dá)量，從而比較蜂王的質(zhì)量。為了研究中蜂幼蟲(chóng)信息素中MP和ML在人工育王中使用能否提高蜂王的質(zhì)量，采用人工移蟲(chóng)育王，在幼蟲(chóng)60—63 h的王臺(tái)內(nèi)分別注射1 μL MP和ML（濃度梯度為0、0.1%、1.0%、10.0%），同樣測(cè)定蜂王初生重、胸重、胸寬和卵巢管數(shù)以及其腹部Vg和Trf表達(dá)量等指標(biāo)?！窘Y(jié)果】免移蟲(chóng)育王的幼蟲(chóng)接受率為40.87%，蜂王出房率38.52%；人工移蟲(chóng)育王的幼蟲(chóng)接受率為74.38%，蜂王出房率69.13%。顯然工蜂對(duì)于人工移蟲(chóng)育王中的蠟質(zhì)王臺(tái)更易于接受。免移蟲(chóng)育王培育的蜂王在初生重、胸重、胸寬、單側(cè)卵巢管數(shù)和Trf表達(dá)量等與人工移蟲(chóng)育王的比較均差異不顯著（P＞0.05），平均值也較接近，但蜂王腹部Vg表達(dá)量顯著高于人工移蟲(chóng)育王（P＜0.05）。在人工移蟲(chóng)育王蜂王幼蟲(chóng)60—63 h時(shí)加入MP（或ML），不同濃度的MP對(duì)蜂王的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；0.1% ML對(duì)蜂王質(zhì)量也無(wú)顯著影響（P＞0.05）；1.0% ML顯著降低蜂王初生重、胸重及其腹部Vg的表達(dá)（P＜0.05），對(duì)卵巢管數(shù)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）；10.0% ML顯著降低蜂王的各項(xiàng)指標(biāo)（P＜0.05）。MP和ML對(duì)蜂王Trf表達(dá)量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）?！窘Y(jié)論】免移蟲(chóng)育王與人工移蟲(chóng)育王相比，王臺(tái)接受率顯著偏低（P＜0.05），蜂王腹部的Vg表達(dá)量增加，但在蜂王初生重、胸部指標(biāo)、單側(cè)卵巢管數(shù)量及Trf表達(dá)量方面均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。MP和ML在人工移蟲(chóng)育王過(guò)程中的應(yīng)用并不能達(dá)到提高蜂王質(zhì)量的作用。

中華蜜蜂；免移蟲(chóng)育王；甲基棕櫚酸酯；甲基亞油酸酯；蜂王質(zhì)量

0　引言

【研究意義】中華蜜蜂（Apis cerana cerana，簡(jiǎn)稱中蜂）是中國(guó)特有的蜂種資源，在山區(qū)廣泛分布，對(duì)生態(tài)環(huán)境的平衡起著至關(guān)重要的作用［1］。但自從中國(guó)引進(jìn)西方蜜蜂（Apis mellifera）以來(lái)，中蜂種群數(shù)量和分布區(qū)域急劇下降［2］，因此開(kāi)展中蜂保護(hù)研究是亟需進(jìn)行的重要工作。在蜂群中，蜂王是唯一具有完整生殖能力的雌性蜂，專職產(chǎn)卵，是蜂群飼養(yǎng)的首要因素。目前在中蜂養(yǎng)殖生產(chǎn)中，每年需定期更換蜂王，但人工培育蜂王仍是難題。大多數(shù)蜂農(nóng)采用自然王臺(tái)換王，使中蜂的種性難以得到改善，易飛逃，分蜂性強(qiáng)，不易維持強(qiáng)群等，長(zhǎng)此以往會(huì)導(dǎo)致飼養(yǎng)的蜂群群勢(shì)越來(lái)越弱。因此，研究適合中蜂的蜂王培育方法，提高育王質(zhì)量，有利于改良中蜂種性，提高生產(chǎn)效益，也對(duì)保護(hù)、開(kāi)發(fā)和利用中蜂這一寶貴資源具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自1888年美國(guó)DOOLITTLE在《科學(xué)育王法》中介紹了人工育王技術(shù)以來(lái)，單式移蟲(chóng)培育蜂王技術(shù)即被普遍采用［3］。20世紀(jì)40年代黃子固在單式移蟲(chóng)育王的基礎(chǔ)上發(fā)明了復(fù)式移蟲(chóng)育王法，并被養(yǎng)蜂者廣泛應(yīng)用［4］。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在人工移蟲(chóng)育王時(shí)，隨著移入幼蟲(chóng)日齡的增加，蜂王的初生重、卵巢管數(shù)、貯精囊直徑、進(jìn)入貯精囊的精子數(shù)等指標(biāo)都明顯下降，即幼蟲(chóng)日齡越小，培育蜂王質(zhì)量越好［5-7］。育王時(shí)王臺(tái)在育王框的位置對(duì)培育的蜂王質(zhì)量有一定的影響，位于育王框中部的王臺(tái)出房的蜂王質(zhì)量較好［8-9］。陳世壁等［10］提出采用大卵育王結(jié)合復(fù)式移蟲(chóng)，可以培育出優(yōu)質(zhì)的處女王。劉光楠等在研究蜂王漿機(jī)械化生產(chǎn)中解決了蜂王漿的人工移蟲(chóng)問(wèn)題［11-13］，同時(shí)設(shè)計(jì)了意大利蜜蜂（Apis mellifer ligustica）的免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器［14］，利用免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器進(jìn)行育王，可以節(jié)省勞動(dòng)力，并有效減少因移蟲(chóng)造成的幼蟲(chóng)機(jī)械性損傷，幼蟲(chóng)底部的大部分王漿也都被轉(zhuǎn)移至王臺(tái)內(nèi)，保證了幼蟲(chóng)被充分哺育，可提高蜂王質(zhì)量。除了在育王方式上的探索，在王臺(tái)內(nèi)添加信息素成分來(lái)提高培育蜂王的質(zhì)量也是研究的一個(gè)方向。LE CONTE等研究表明西方蜜蜂幼蟲(chóng)信息素中的甲基亞油酸酯（methyl linoleate，ML）和甲基油酸酯（methyl oleate，MO）可分別促進(jìn)單個(gè)王臺(tái)內(nèi)王漿量和王臺(tái)接受率，而甲基棕櫚酸酯（methyl palmitate，MP）可以提高育王過(guò)程中單個(gè)幼蟲(chóng)質(zhì)量［15-17］。顏偉玉等［18］研究發(fā)現(xiàn)中蜂的幼蟲(chóng)信息素成分與西方蜜蜂的相似，包括甲基棕櫚酸酯、甲基亞油酸酯、甲基油酸酯、甲基硬脂酸酯、甲基亞麻酸酯、乙基棕櫚酸酯、乙基亞油酸酯、乙基油酸酯、乙基硬脂酸酯和乙基亞麻酸酯；曾云峰等［19］在育王過(guò)程中添加信息素，發(fā)現(xiàn)0.1%的MP可提高中蜂和意蜂幼蟲(chóng)質(zhì)量；周冰峰等［20］以中華蜜蜂為試驗(yàn)材料，將保幼激素類似物ZR512注入王臺(tái)內(nèi)的蜂王漿讓幼蟲(chóng)吸收，發(fā)現(xiàn)ZR512可顯著提高蜂王初生重。對(duì)蜂王質(zhì)量的評(píng)價(jià)通常采用初生重、卵巢管數(shù)量、胸重、胸寬等指標(biāo)，對(duì)與蜂王卵巢發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)研究較少。CORONA等［21］研究表明卵黃原蛋白基因（Vitellogenin，Vg）的表達(dá)量與蜂王卵巢發(fā)育等級(jí)呈正相關(guān)，還與蜂王的壽命相關(guān)。KOYWIWATTRAKUL等［22］研究發(fā)現(xiàn)Vg和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因（Transferrin，Trf）在卵巢發(fā)育的工蜂表達(dá)量顯著高于卵巢未發(fā)育的工蜂，Vg和Trf表達(dá)量的上調(diào)將通過(guò)一系列下游反應(yīng)使卵巢活化，刺激工蜂產(chǎn)卵行為?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于中蜂嗅覺(jué)靈敏，分蜂性強(qiáng)，難以維持強(qiáng)群等特點(diǎn)，在移蟲(chóng)或移卵過(guò)程中稍有不慎便會(huì)對(duì)卵或幼蟲(chóng)造成傷害，進(jìn)而被工蜂清理，導(dǎo)致蜂王培育難以成功。隨著養(yǎng)蜂人員的老齡化，養(yǎng)蜂者的視力明顯下降，難以進(jìn)行正常的移蟲(chóng)，也使得育王變得困難。借鑒意大利蜜蜂免移蟲(chóng)育王的經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)中蜂的生物學(xué)特性，設(shè)計(jì)適合中蜂的免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器，并與人工移蟲(chóng)育王進(jìn)行比較。利用蜜蜂幼蟲(chóng)信息素探索中蜂優(yōu)質(zhì)蜂王培育在國(guó)內(nèi)也鮮有相關(guān)研究報(bào)道，如果在育王時(shí)添加幼蟲(chóng)信息素成分能提高蜂王發(fā)育質(zhì)量，那將為中蜂優(yōu)質(zhì)蜂王培育開(kāi)辟一條新的途徑?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究免移蟲(chóng)育王與人工移蟲(chóng)育王對(duì)王臺(tái)接受率、蜂王初生重、胸重、胸寬、卵巢管數(shù)量和Vg、Trf表達(dá)水平的影響，并探索在育王過(guò)程中分別添加MP和ML對(duì)蜂王質(zhì)量的影響，確定適合中蜂優(yōu)質(zhì)蜂王培育的方法。

1　材料與方法

試驗(yàn)于2015年4—11月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所試驗(yàn)蜂場(chǎng)（28.46°N，115.49°S）完成。

1.1試驗(yàn)蜂群

蜂群為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的中華蜜蜂。選擇蜂群群勢(shì)、蜂王年齡、子脾面積基本一致的健康蜂群3群作為哺育群，群勢(shì)均為5框，采用郎氏標(biāo)準(zhǔn)蜂箱飼養(yǎng)。另選擇一群健康、蜂王產(chǎn)卵性能好的蜂群作為母本群。育王在哺育群中進(jìn)行，比較免移蟲(chóng)育王和人工移蟲(chóng)育王過(guò)程中，每群每種育王方式至少育王3次。幼蟲(chóng)信息素試驗(yàn)組，每種信息素每群至少采用人工移蟲(chóng)法育王3次。試驗(yàn)期間，對(duì)蜂群進(jìn)行獎(jiǎng)勵(lì)飼喂，提高工蜂哺育積極性。

1.2免移蟲(chóng)育王

免移蟲(chóng)育王是利用自主設(shè)計(jì)生產(chǎn)的中華蜜蜂免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器［23］進(jìn)行蜂王培育。中華蜜蜂免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器由人工塑料巢礎(chǔ)、無(wú)底單個(gè)王臺(tái)、托蟲(chóng)器、配套王臺(tái)條等幾部分組成［24］。王臺(tái)內(nèi)徑8.0 mm，高度為7.0 mm。中蜂免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器采用塑料材質(zhì)制造單面塑料巢礎(chǔ)，并在單個(gè)巢房底部中間預(yù)留小孔，用于安裝相同孔徑的托蟲(chóng)器。將巢礎(chǔ)鑲嵌于巢框時(shí)在巢脾背面加入抽拉式有機(jī)玻璃，可防止工蜂進(jìn)入吐蠟造脾。將巢框放入蜂群中造脾，造脾成功后使用配套隔王裝置控制蜂王于巢脾上產(chǎn)卵，待卵孵化成幼蟲(chóng)（即1日齡）時(shí)，拔出托蟲(chóng)器安裝于配套塑料王臺(tái)中，置于王臺(tái)條上，然后轉(zhuǎn)移至哺育群中。王臺(tái)封蓋第5天再將育王框取出，單個(gè)王臺(tái)小心取下至于王籠中，放置恒溫恒濕培養(yǎng)箱孵化（T：35℃，RH：70%）（下同）。

1.3人工移蟲(chóng)育王

人工移蟲(chóng)育王采用蘸蠟棒自制蠟質(zhì)王臺(tái)，內(nèi)徑8.0 mm，蘸蠟深度為7.0 mm。試驗(yàn)采用人工復(fù)式移蟲(chóng)育王，第1天移入非試驗(yàn)用1日齡工蜂幼蟲(chóng)，并在次日中午移出王臺(tái)內(nèi)幼蟲(chóng)，采用試驗(yàn)用1日齡工蜂幼蟲(chóng)進(jìn)行第2次移蟲(chóng)。

1.4信息素處理

試驗(yàn)前用正己烷分別溶解MP和ML，分別配制成濃度為0（純正己烷，作為對(duì)照組）、0.1%、1.0%、10.0%的溶液。控制蜂王產(chǎn)卵4 h，卵經(jīng)過(guò)3 d孵化為1日齡幼蟲(chóng)，采用人工復(fù)式移蟲(chóng)育王進(jìn)行蜂王培育。在幼蟲(chóng)60—63 h時(shí)取出育王框，將1 μL不同濃度信息素分別注入王臺(tái)內(nèi)的王漿中，并做標(biāo)記。注射完畢，將育王框小心放回蜂群中。

1.5王臺(tái)接受率測(cè)定

記錄移蟲(chóng)數(shù)、移蟲(chóng)第3天幼蟲(chóng)接受數(shù)和羽化蜂王數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析幼蟲(chóng)接受率和蜂王出房率，公式如下：

幼蟲(chóng)接受率=第3天幼蟲(chóng)接受數(shù)/第1天移蟲(chóng)數(shù)× 100%；

蜂王出房率=蜂王出房數(shù)/第1天移蟲(chóng)數(shù)×100%。

1.6蜂王外部指標(biāo)測(cè)定

蜂王羽化出房后利用電子天平稱取初生重；剪取蜂王胸部、去翅足后稱取胸重，采用江南永新光學(xué)有限公司CCD觀察測(cè)試系統(tǒng)測(cè)量蜂王胸部寬度。

1.7蜂王卵巢管數(shù)量測(cè)定

參照甘海燕等［25］的方法，采用石蠟切片法測(cè)定蜂王卵巢管數(shù)。蜂王羽化出房后饑餓5 h，處死后將蜂王置于10%的甲醛溶液中固定4 h，解剖蜂王，再次將卵巢放回10%的甲醛固定液浸泡12 h左右，經(jīng)一系列由低到高濃度的乙醇脫水，二甲苯透明后，進(jìn)行浸蠟處理（具體過(guò)程同表1），石蠟包埋后，在切片機(jī)上切成5 μm厚的切片，在攤片機(jī)上展開(kāi)，展好的切片在室溫下干燥或置于40℃恒溫箱中30 min，蘇木精-伊紅染色，封片。每個(gè)樣品觀察3個(gè)切片，取平均值。

1.8熒光定量PCR測(cè)定蜂王腹部Vg和Trf表達(dá)量

活體解剖初生蜂王腹部，采用去除消化道的蜂王腹部（包含內(nèi)部的卵巢及卵巢上附著的脂肪組織），RNA提取和cDNA合成參考秦秋紅［26］的方法。根據(jù)GenBank中相關(guān)序列，采用Primer 5設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物有限公司合成（表2）。熒光定量PCR采用10 μL體系，各反應(yīng)成分含量見(jiàn)表3。上下游引物、滅菌水、ROX和SYBR GREENⅡ（TaKaRa公司）計(jì)算多孔總量制成混液后添加至單孔中，cDNA最后單獨(dú)加入八連管中。每個(gè)基因預(yù)留三孔陰性對(duì)照，均加入混液，但用滅菌超純水代替cDNA。qRT-PCR反應(yīng)條件：第一步95℃預(yù)變性30 s；第二步進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，10 s；60℃，1 min）。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后從55℃緩慢加熱至95℃，建立熔解曲線。

表1　脫水透明具體步驟及浸泡時(shí)間Table 1　Specific steps and soaking time of dehydration

表2　基因引物信息Table 2　The primer sequences of the genes

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

蜂王外部指標(biāo)及卵巢管數(shù)量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用StatView軟件“ANOVA and t-test”中的“ANOVA or ANCOVA”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。蜂王腹部Vg和Trf表達(dá)量利用2-ΔΔCt公式計(jì)算。

表3　熒光定量PCR反應(yīng)體系Table 3　Reaction system of qRT-PCR assay

2　結(jié)果

2.1免移蟲(chóng)育王對(duì)中蜂蜂王質(zhì)量的影響

2.1.1王臺(tái)接受率免移蟲(chóng)育王和人工移蟲(chóng)育王的幼蟲(chóng)接受率分別為40.87%和74.38%，差異顯著（P＜0.05）；蜂王出房率分別為38.52%和69.13%，差異顯著（P＜0.05）。由于免移蟲(chóng)育王采用的是塑料王臺(tái)，中蜂不易接受，因此幼蟲(chóng)接受率偏低，導(dǎo)致蜂王出房率也顯著偏低（表4）。

2.1.2蜂王相關(guān)指標(biāo)免移蟲(chóng)育王和人工移蟲(chóng)育王在蜂王初生重、胸重、胸寬和卵巢管數(shù)等指標(biāo)均差異不顯著（P＞0.05），除蜂王初生重外其他各項(xiàng)指標(biāo)平均值都比較接近。因此，免移蟲(chóng)育王和人工移蟲(chóng)育王培育的蜂王在外部指標(biāo)上并無(wú)顯著差異（表5）。

2.1.3蜂王腹部Vg和Trf表達(dá)量免移蟲(chóng)育王培育的蜂王腹部Vg表達(dá)量顯著高于人工移蟲(chóng)育王的蜂王（圖1-A，P＜0.05），但Trf表達(dá)量無(wú)顯著差異（圖1-B，P＞0.05）（圖1）。

2.2甲基棕櫚酸酯對(duì)中蜂蜂王的質(zhì)量影響

2.2.1對(duì)蜂王相關(guān)指標(biāo)的影響由表6可知，不同濃度MP對(duì)蜂王的初生重、胸重、胸寬和卵巢管數(shù)量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

2.2.2對(duì)蜂王腹部Vg和Trf的影響不同濃度的MP對(duì)蜂王腹部Vg（圖2-A）和Trf（圖2-B）表達(dá)水平均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表4　育王方式對(duì)王臺(tái)接受率的影響Table 4　The effect of queen rearing method on the acceptance rate of queen cell

表5　育王方式對(duì)蜂王相關(guān)指標(biāo)的影響Table 5　The effect of queen-rearing method on the index of queens

圖1　免移蟲(chóng)育王和人工移蟲(chóng)育王蜂王腹部Vg和Trf表達(dá)量Fig. 1　The expression level of Vg and Trf in queen-rearing without and with larvae-grafting

表6　MP對(duì)蜂王相關(guān)指標(biāo)的影響Table 6　The effect of methyl palmitate on the index of queens

圖2　MP對(duì)蜂王腹部Vg和Trf表達(dá)量影響Fig. 2　The effect of methyl palmitate on the expression level of Vg and Trf in queen's abdomen

2.3甲基亞油酸酯對(duì)中蜂蜂王質(zhì)量的影響

2.3.1對(duì)蜂王相關(guān)指標(biāo)的影響0.1% ML對(duì)蜂王初生重、胸部指標(biāo)等均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；1.0%甲基亞油酸酯顯著降低了蜂王初生重及胸重（P＜0.05），對(duì)胸寬和卵巢管數(shù)量無(wú)顯著影響；10.0%甲基亞油酸酯顯著地降低了蜂王的初生重、胸部指標(biāo)及卵巢管數(shù)量（P＜0.05）（表7）。

2.3.2對(duì)蜂王腹部Vg和Trf的影響 0.1% ML對(duì)蜂王Vg表達(dá)量無(wú)顯著影響（P＞0.05），但1.0%和10.0% ML顯著降低了蜂王腹部Vg的表達(dá)量（圖3-A，P＜0.05）；各濃度ML對(duì)蜂王腹部Trf表達(dá)水平均無(wú)顯著影響（圖3-B，P＞0.05）。

表7　ML對(duì)蜂王相關(guān)指標(biāo)的影響Table 7　The effect of methyl linoleate on the index of queens

3　討論

中蜂免移蟲(chóng)育王的幼蟲(chóng)接受率顯著低于人工移蟲(chóng)育王的幼蟲(chóng)接受率，這與劉光楠等［14］對(duì)意大利蜜蜂的試驗(yàn)結(jié)果相似。由于免移蟲(chóng)育王是待卵在巢房中孵化為小幼蟲(chóng)后再將托蟲(chóng)器拔下，插至王臺(tái)底部，不會(huì)對(duì)幼蟲(chóng)造成機(jī)械性損傷，因此幼蟲(chóng)接受率顯著偏低的主要原因是工蜂對(duì)塑料王臺(tái)的排斥。有研究表明中蜂育王時(shí)工蜂更易于接受蠟質(zhì)王臺(tái)［27］，這可能與中蜂靈敏的嗅覺(jué)［28-29］有關(guān)。在使用免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器時(shí)，可使用舊巢脾水浸泡、在塑料臺(tái)基表面涂一薄層蜂蠟、密集蜂群群勢(shì)等使蜜蜂適應(yīng)塑料王臺(tái)，提高幼蟲(chóng)的接受率，從而提高育王效率。

圖3　ML對(duì)蜂王腹部Vg和Trf表達(dá)量的影響Fig. 3　The effect of methyl linoleate on the expression level of Vg and Trf in queen's abdomen

免移蟲(chóng)育王培育的蜂王在初生重、胸部指標(biāo)、卵巢管數(shù)量和Trf表達(dá)量等與人工移蟲(chóng)育王的比較并無(wú)顯著差異，但Vg的表達(dá)量更高。Vg是一種多效性基因，與蜜蜂卵巢活性、壽命、免疫力等均具有一定相關(guān)性［30］。Vg含量高低可能與蜂王體內(nèi)的保幼激素滴度或蛻皮激素水平有關(guān)，但具體機(jī)理尚不清楚。免移蟲(chóng)育王培育的蜂王在交尾后的產(chǎn)卵力、壽命和免疫力方面是否表現(xiàn)更為優(yōu)越也有待于進(jìn)一步的研究。一個(gè)免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器一次可提供81個(gè)用于育王的幼蟲(chóng)，按38%出房率計(jì)算，有30只蜂王出房，這基本能滿足一個(gè)普通蜂場(chǎng)的換王需求。免移蟲(chóng)育王還可以減少勞動(dòng)強(qiáng)度，對(duì)于年齡偏大、視力不佳的養(yǎng)蜂人員來(lái)說(shuō)是一種較佳的育王方式，因此可以用來(lái)代替人工移蟲(chóng)育王。但在后期對(duì)免移蟲(chóng)育王生產(chǎn)器的改進(jìn)中也應(yīng)對(duì)塑料材質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步地篩選，使中蜂更易于接受，提高幼蟲(chóng)的接受率。

LE CONTE等［16］以意大利蜜蜂為試驗(yàn)材料，研究發(fā)現(xiàn)ML可通過(guò)調(diào)節(jié)工蜂的哺育行為而增加王臺(tái)內(nèi)王漿含量。曾云峰等［19］研究表明，0.1%和1.0%的MP對(duì)中蜂王臺(tái)接受率和王臺(tái)中的王漿質(zhì)量無(wú)顯著影響，但單個(gè)幼蟲(chóng)的質(zhì)量顯著增加。本試驗(yàn)在中蜂育王過(guò)程中添加不同濃度的MP，對(duì)蜂王的各項(xiàng)指標(biāo)及Vg和Trf表達(dá)并無(wú)顯著影響。1.0%的ML顯著降低了蜂王的初生重、胸重及Vg的表達(dá)；當(dāng)濃度為10.0%時(shí)，蜂王的胸寬與卵巢管數(shù)也顯著降低，因此過(guò)高的濃度可能降低了工蜂的哺育積極性，使蜂王質(zhì)量下降。因此，在中蜂育王過(guò)程中添加MP和ML并不能達(dá)到提高蜂王質(zhì)量的目的。本試驗(yàn)只研究了中蜂幼蟲(chóng)信息素中兩種單一酯類對(duì)育王質(zhì)量的影響，幼蟲(chóng)信息素中這兩種酯類的釋放特點(diǎn)、其他酯類、不同酯類成分組合及10種酯類混和對(duì)育王效果的影響，還有待于進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

免移蟲(chóng)育王和人工移蟲(chóng)育王培育的蜂王比較，在外部指標(biāo)、卵巢管數(shù)量和Trf表達(dá)量方面均無(wú)顯著差異，王臺(tái)接受率顯著偏低，但免移蟲(chóng)育王的蜂王Vg表達(dá)量顯著高于人工移蟲(chóng)育王。在育王過(guò)程中使用甲基棕櫚酸酯和甲基亞油酸酯不能起到提高蜂王質(zhì)量的作用。

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（責(zé)任編輯岳梅）

Effects of Queen-Rearing Without Larvae-Grafting and Two Esters of Brood Pheromone on the Queen Quality of Apis cerana cerana

ZOU Chui-bin1， ZHOU Lin-bin1， HU Jing-hua1， XI Fang-gui2， YUAN Fang2， YAN Wei-yu1
（1Honeybee Research Institute， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045；2Apiculture Research Institute of Jiangxi Province，Nanchang 330052）

【Objective】The objective of this study is to compare the queen quality of queen-rearing with and without larvae-grafting and investigate whether methyl palmitate （MP） and methyl linoleate （ML） used in the process of queen rearing could improve the queen quality.【Method】Three colonies of Apis cerana cerana were chosen as experimental colonies， each colony with 5 combs， were basically the same in the honeybee population， queen age and brood comb area. These colonies were maintained using standard beekeeping techniques. Another strong colony with well egg-laying queen was served as egg-laying colony. The queen was reared at least 3 times in each colony during the queen-rearing with and without larvae-grafting experiment. And the queen was reared at least 3 times for different brood pheromone in each colony with queen-rearing with larvae-grafting method. Stimulated fed the colony to improve the worker nursing enthusiasm during the period of queen-rearing. Comparing the queen quality by testing the acceptance rate of queen cells， the weight， thorax weight and width of newly-emerged queens reared from the queen-rearing with and without larvae-grafting. The gene expression of vitellogenin （Vg） and transferrin （Trf） of the queens were tested by qRT-PCR， and the ovarioles were counted by paraffin section. In order to verify whether MP or ML used in the process of queen-rearing can improve the queen quality， 1μL solution which contains 0， 0.1%， 1.0% and 10.0% of MP or ML was added into the queen cells with 60-63 h old queen larvae， respectively. The queen quality was also detected.【Result】The rate of brood accepted and the percent of queen emerged in queen-rearing without larvae-grafting was 40.87% and 38.52%. In queen-rearing with larvae-grafting it was 74.38% and 69.13%， respectively. So apparently it is easier to accept the wax queen cell than the plastic for workers. No significant difference in the newly-emerged weight， thorax weight and width， ovarioles number in one side and Trf expression was observed between these two queen-rearing methods （P＞0.05）. It was also similar in the average value. Nevertheless， Vg expression in queens from queen-rearing without larvae-grafting was significantly higher than that in the larvae-grafting （P＜0.05）. 0.1% ML and all concentrations of MP showed no significant effect on all parameters （P＞0.05）， and gene expression of Trf was also not different among all treatments （P＞0.05）. 1.0% ML significantly reduced the newly-emerged weight， thorax weight and Vg expression of queens （P＜0.05）， and 10.0% ML significantly reduced the index， ovarioles number and Vg expression of queens （P＜0.05）. There was no significant effect on Trf expression level in both MP and ML （P＞0.05）.【Conclusion】The acceptance rate of queen cell was significantly lower （P＜0.05） in queen-rearing without larvae-grafting compared with larvae-grafting. There was no significant difference in the newly-emerged weight，thorax weight and width， ovarioles number and Trf expression of the queens between queen-rearing with and without larvae-grafting （P＞0.05）， but Vg expression was considerably higher whereas the acceptance rate of queen cells was lower in queen-rearing without larvae-grafting （P＜0.05）. ML and MP used in queen-rearing process could not improve the queen quality.

Apis cerana cerana； queen-rearing without larvae-grafting； methyl palmitate； methyl linoleate； queen quality

2016-05-09；接受日期：2016-07-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（31460641）、江西省青年科學(xué)家（井岡之星）培養(yǎng)對(duì)象項(xiàng)目（20133BCB23012）、江西省教育廳項(xiàng)目（GJJ14278）

聯(lián)系方式：鄒垂彬，E-mail：xynn0192@163.com。通信作者顏偉玉，E-mail：ywygood-0216@163.com