高氧氣調包裝對宰后豬肉蛋白質氧化、鈣蛋白酶活性及蛋白質降解的影響

陳　琳，周光宏，徐幸蓮，張萬剛

（南京農業大學食品科技學院/肉品加工與質量控制教育部重點實驗室/食品安全與營養協同創新中心，南京 210095）

高氧氣調包裝對宰后豬肉蛋白質氧化、鈣蛋白酶活性及蛋白質降解的影響

陳琳，周光宏，徐幸蓮，張萬剛

（南京農業大學食品科技學院/肉品加工與質量控制教育部重點實驗室/食品安全與營養協同創新中心，南京 210095）

【目的】研究高氧氣調包裝（HiOx，80% O2/20% CO2）對宰后豬肉蛋白質氧化、鈣蛋白酶活性及蛋白質降解的影響，探討高氧氣調包裝影響豬肉品質的內在機制。【方法】選取12條冷卻（4℃）24 h后的杜洛克×長白×約克夏三元雜交豬背最長肌，分別進行高氧氣調包裝和真空包裝（VP），4℃冷庫貯藏，分別在1、4、6 d測定羰基含量及分布、巰基含量、肌節變化、鈣蛋白酶活性、肌聯蛋白及肌鈣蛋白-T降解變化。【結果】高氧氣調包裝組羰基含量高于真空包裝組且貯藏第4和6天差異顯著（P＜0.05）。貯藏第1和4天，高氧氣調包裝組肌細胞外圍出現羰基氧化熒光信號，熒光以靠近細胞膜處密度更高，并且逐漸向細胞內部擴散；貯藏第6天，高氧氣調包裝組細胞膜呈高亮熒光圈，胞內熒光增強，而真空包裝組熒光信號較弱。貯藏第6天，高氧氣調包裝組巰基含量顯著低于真空包裝組（P＜0.05）。真空包裝組宰后肌節M線弱化、A帶模糊、肌原纖維Z線斷裂；高氧氣調包裝組肌節結構相對完整。高氧氣調包裝組在貯藏第1天鈣蛋白酶活性顯著低于真空包裝組（P＜0.05）；高氧氣調包裝抑制了肌聯蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，且在貯藏第4和6天差異顯著（P＜0.05）。【結論】高氧氣調包裝能夠顯著提高宰后豬肉蛋白質氧化程度，抑制鈣蛋白酶活性發揮及其底物蛋白質的降解。

豬肉；高氧氣調包裝；真空包裝；蛋白質氧化；鈣蛋白酶活性；蛋白質降解

0　引言

【研究意義】隨著人們生活節奏的加快，包裝銷售因其高度便捷性受到越來越多消費者的歡迎。高氧氣調包裝、真空包裝以及透氧包裝是目前肉制品行業3大主要包裝方式。高氧氣調包裝常以80%O2和20%CO2相混合的方式對肉品進行包裝，一方面高濃度氧氣的存在可以使冷卻肉呈現亮紅色，更能刺激消費者的購買欲；另一方面，二氧化碳能夠抑制微生物生長而延長商品貨架期［1-2］。然而高氧氣調包裝的富氧環境不可避免會帶來蛋白質氧化的問題［3］，加強此方面的研究，對探討高氧氣調包裝影響豬肉品質的內在機制具有重要意義。【前人研究進展】前期研究表明氧化會導致蛋白質羰基化，一些必需氨基酸如精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸結構上會發生不可逆轉的氧化修飾，使得蛋白質功能喪失［4-5］。現已證實［6-7］，蛋白質氧化能夠導致肽鏈及功能基團結構改變、蛋白酶活性喪失、影響蛋白水解敏感性，以及促進分子間交聯、聚集產生。動物宰后肌肉成熟過程會發生一系列復雜的生理生化變化。其中，肌原纖維蛋白以及一些肌肉骨架蛋白的降解，對維持肌原纖維結構完整性十分重要。蛋白水解會破壞肌原纖維結構的完整性，改變肌細胞的有序結構，影響肌細胞間收縮與傳導過程，從而影響肌細胞內水分含量、分布以及肉質嫩化［8-9］。而這些蛋白被認為是鈣蛋白酶所降解的底物蛋白［10］。宰后早期鈣蛋白酶活性的變化被認為是調控肉品質改善的關鍵原因之一［10-11］。然而，鈣蛋白酶的活性位點上存在組氨酸以及含有巰基的半胱氨酸殘基，這些是極易被氧化的基團，從而使鈣蛋白酶因氧化而喪失活性［12］。ROWE等［13］對牛肉進行輻照氧化處理，證實了蛋白質氧化可通過抑制鈣蛋白酶活性來降低宰后成熟過程中蛋白質降解程度，輻照氧化組嫩度顯著低于未輻照組，且肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T降解產物更少，鈣激活酶的自溶程度較低。然而，蛋白質氧化調控宰后肉品品質的具體機制尚不清楚。【本研究切入點】目前，在肉的成熟過程中，肌原纖維蛋白和與其降解相關的關鍵酶被氧化后，底物蛋白的結構、降解情況變化以及關鍵酶的活性變化尚未被闡明，有關高氧氣調包裝下蛋白質氧化影響豬肉鈣蛋白酶活性、底物蛋白質降解等尚無報道。【擬解決的關鍵問題】本試驗以高氧氣調包裝和真空包裝的杜洛克×長白×約克夏三元雜交豬背最長肌為研究對象，從蛋白質氧化、鈣蛋白酶活性及蛋白質降解3方面揭示高氧氣調包裝影響宰后豬肉成熟品質的內在機制，為指導高氧氣調包裝方式的生產應用提供理論依據。

1　材料與方法

試驗于2015年在南京農業大學食品科技學院進行。

1.1材料與試劑

試驗以杜洛克×長白×約克夏三元雜交商品豬背最長肌為研究對象。采樣6頭6月齡、活體重為（100±5）kg健康商品豬，于江蘇淮安蘇食屠宰場宰殺。在4℃冷庫排酸24 h，取左右背最長肌共12條。

聚丙烯熱成型托盤、封口膜和真空包裝袋，快衛爾（中國）有限公司；DNPH（2，4-二硝基苯肼，2，4-dinitrophenylhydrazine）和DTNB（5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸，5，5'-Dithiobis-2-nitrobenzoic acid），上海阿拉丁試劑有限公司；鹽酸胍（國藥集團化學試劑公司）；TCA（三氯乙酸，trichloroacetic acid），上海凌峰化學試劑有限公司；CY3-羊抗兔IgG（BA1032）、山羊及兔血清，武漢博士得公司；DNPH抗體（D9556）和肌鈣蛋白-T抗體（T6277），美國Sigma-Aldrich公司；HRP標記羊抗鼠IgG（ab6789），英國Abcam公司；ECL化學發光試劑盒（NCI4106）和BCA試劑盒（23250），美國Thermo公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液（161-0732）和聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移液（161-0734），美國Bio-Rad公司；蛋白預制凝膠（W002-6），南京建成化學試劑公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器與設備

Smart 500氣調包裝機，西班牙Ulma包裝公司；真空包裝機，美國快衛爾包裝公司；H-7650透射電子顯微鏡，日本日立公司；LSM 700 META激光共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司；CM1950超薄冷凍切片機，德國Leica公司；PowerPac 1000垂直電泳儀和Mini-protein Tetra Cell電泳設備，美國Bio-Rad公司；ImageQuant LAS 4000分子成像系統和Imagescanner凝膠成像系統，美國GE公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；Spectral Max M2e酶標儀，美國MDC公司；Ultra Turrax T25 BASIS高速勻漿機，德國IKA公司；Avanti J-E落地式高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；TW20水浴鍋，德國Julabo公司；低溫冰柜，日本Hitachi公司。

1.3方法

1.3.1樣品包裝剔除背最長肌表面筋膜、脂肪及結締組織，均分為3塊，修剪成厚約2.5 cm、重400 g左右的肉塊，肉樣隨機分為兩組分別進行高氧氣調包裝和真空包裝。高氧氣調包裝：首先將樣品放入聚丙烯熱成型托盤（6 cm×23 cm×13 cm）中，采用填充比例為80% O2/20% CO2、充氣壓力為105 kPa的混合氣體，于140℃封口（標準大氣壓下封口膜透氧率＜1 cm3·m-2·d-1）完成高氧氣調包裝。真空包裝：采用聚丙烯材質的真空包裝袋，標準大氣壓下透氧率＜30 cm3·m-2·d-1，真空包裝機抽真空至氣壓＜1 kPa，抽空30 s，100℃熱封5 s。兩種包裝的肉樣在4℃冷庫中貯藏，在第1、4、6天取樣進行指標測定。

1.3.2肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的制備肌原纖維蛋白提取參考XIONG［14］并稍作修改。將包裝成熟1、4、6天肉樣取出，稱取1 g剔除脂肪及筋膜的樣品，加入5倍體積的肌原纖維蛋白提取液（10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液、100 mmol·L-1氯化鈉、2 mmol·L-1氯化鎂、1 mmol·L-1EGTA，pH 7.0）。4℃勻漿30 s，10 s間隔一次，轉速為15 000 r/min。勻漿液以1 000×g轉速離心10 min，取沉淀。以上步驟重復3次。離心后沉淀中加入5倍體積的100 mmol·L-1氯化鈉洗脫液。15 000 r/min轉速勻漿30 s，10 s間隔一次。勻漿液以1 000×g轉速離心10 min，取沉淀，以上步驟重復3次。離心后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。肌原纖維蛋白與電泳上樣緩沖液（125 mmol·L-1Tris-base、4% SDS、20%甘油、0.5% β-巰基乙醇、0.1%溴酚藍，pH 6.8）充分混合，BCA試劑盒法測定肌原纖維蛋白濃度后統一蛋白質濃度為7 mg·mL-1。蛋白質溶液按體積比1∶1與電泳上樣緩沖液混合，50℃水浴20 min。分裝樣品，-80℃存放用于蛋白電泳檢測。

肌漿蛋白的提取參考VEISETH等［15］的方法并稍作修改。將包裝后成熟1 d的肉樣取出，稱取1 g剔除筋膜和脂肪的肉樣，加入3倍體積4℃預冷的活性蛋白提取液（100 mmol·L-1Tris-base、0.1% β-巰基乙醇、10 mmol·L-1EDTA，pH 8.3），15 000 r/min勻漿2次，每次15 s，5 s間隔一次。勻漿液以轉速15 000 ×g，4℃離心30 min，所得上清通過濾紙過濾后，BCA試劑盒法測定蛋白質濃度。去離子水調節統一蛋白質濃度為8 mg·mL-1，按蛋白體積∶活性電泳上樣緩沖液（150 mmol·L-1Tris-base、20%甘油、0.75% β-巰基乙醇、0.02%溴酚藍，pH 6.8）=1∶1進行稀釋。混合后樣品進行分裝，-80℃冷凍用于鈣蛋白酶活性檢測。

1.3.3羰基含量測定參考ZHANG等［7］的方法并稍作修改。稱取0.5 g剔除脂肪及筋膜的肉樣，加入5 mL焦磷酸鹽緩沖液勻漿3次，每次10 s，轉速最高為15 000 r/min。取0.5 mL勻漿液置于2個2 mL離心管中，加入0.5 mL 20%三氯乙酸（TCA），振蕩混勻后以12 000×g離心5 min。除去上清液，沉淀加入0.5 mL 10% TCA振蕩混勻后再次離心，離心條件同上。對照組將離心后沉淀加0.5 mL 2 mol·L-1HCl，試驗組加0.5 mL 10 mmol·L-12，4-二硝基苯肼（DNPH）。暗處理30 min，每隔10 min迅速取出混勻10 s。待DNPH與羰基充分反應，對照組與試驗組加入0.5 mL 20% TCA，振蕩混勻后相同條件離心。沉淀用10 mmol·L-1HCl（溶解于1∶1（vol/vol）乙醇/乙酸乙酯）重復洗脫3次。所得沉淀加入1 mL 6 mol·L-1鹽酸胍（溶解在20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液，pH 2.3），4℃震蕩過夜。未溶解物12 000×g離心5 min，上清液在紫外370 nm處測定吸光度。消光系數為22 000 L·mol-1·cm-1，羰基含量用每毫克蛋白里含有羰基的納摩爾數表示。

1.3.4羰基肌細胞內分布測定采用免疫熒光法，參考ASTRUC等［16］的方法并做一定修改。將包裝后成熟1、4、6 d的肉樣取出，隨機選取肉樣區域沿著平行于肌原纖維方向將肌肉切成肉條并立即浸泡于液氮中30 s，每個肉樣取6個平行。冰凍超薄切片機切取10 μm厚切片，37℃烘干2 h后與0.04% DNPH（溶解在20 mmol·L-1磷酸鹽和0.1 mol·L-1氯化鈉的混合液中，pH 6.0）暗處反應16 h。反應結束后樣品用含0.1%吐溫的PBS（pH 6.75）重復沖洗（5 min，6次）。37℃兔血清一次封閉切片1 h。去除封閉液，滴加1∶100稀釋DNPH多克隆抗體孵育，4℃反應過夜。一抗孵育結束后，切片樣品用含0.1%吐溫的PBS（pH 6.75）重復沖洗（5 min，6次），37℃山羊血清二次封閉1 h。去除封閉液，滴加CY3標記的羊抗兔免疫球蛋白溶液（1∶50）避光孵育1 h，PBS漂洗（5 min，6次）。采用激光共聚焦顯微鏡在激發波長555 nm、發射波長570 nm下，將樣品放大200倍，統一曝光時間下觀察羰基在肌細胞內分布。

1.3.5巰基含量測定巰基測定參考ELLMAN［17］的方法，并稍作修改。0.5 mL肌原纖維蛋白溶液（4 mg·mL-1）加入4.5 mL緩沖液（50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液、10 mmol·L-1EDTA、0.6 mol·L-1氯化鉀，pH 7.0），與0.5 mL 10 mmol·L-15、5-二硫代-2-硝基苯甲酸（0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液配置，pH 8.0）混合均勻。混合液在40℃水浴中反應25 min，412 nm處測定吸光度值。摩爾吸光系數為136 000 L·mol-1·cm-1，活性巰基含量用每毫克蛋白里含有巰基的納摩爾數表示。

1.3.6電鏡觀察肌節變化參考徐舶等［18］方法，將成熟1、4、6 d的樣品沿著肌原纖維方向切成約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉條，肉條浸泡在2.5%戊二醛中（20 mmol·L-1磷酸緩沖液溶解，pH 7.2）初步固定7 d，每隔一天更新戊二醛固定液。樣品用2%餓酸二次固定，固定完成后經磷酸緩沖液反復沖洗，梯度乙醇脫水，100%丙酮置換，最后采用Spurr樹脂浸透包埋。超薄切片機進行切片，日立H-7650透射顯微鏡將樣本放大3 000倍觀察肌節變化。

1.3.7鈣蛋白酶活性測定參考酪蛋白酶原法［19］，采用4%的濃縮膠（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=75∶1， 125 mmol·L-1Tris-base（pH 6.8），0.05%過硫酸銨，0.05%四甲基乙二胺）和12.5%的分離膠（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=75∶1，375 mmol·L-1Tris-base（pH 8.8），2.1 mmol·L-1酪蛋白，0.05%過硫酸銨，0.05% 四甲基乙二胺）。緩慢加入4℃預冷的電泳緩沖液（25 mmol·L-1Tris-base，192 mmol·L-1甘氨酸，1 mmol·L-1EDTA，0.05% β-巰基乙醇），接通電源100 V，預跑15 min后上樣。蛋白樣品在100 V、4℃環境電泳6 h至電泳結束。活性電泳反應液（50 mmol·L-1Tris-base、 5 mmol·L-1氯化鈣、0.1% β-巰基乙醇，pH 7.8）室溫孵育膠體前1 h，每20 min更換活性電泳反應液。繼續孵育16 h后膠體進行染色和脫色，凝膠成像儀拍照。鈣蛋白酶活性條帶采用Quanity one分析軟件進行半定量分析。

1.3.8肌聯蛋白和肌鈣蛋白-T降解測定肌聯蛋白采用5%的連續聚丙烯酰胺連續電泳（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=100∶1，1.5 mol·L-1Tris-base（pH 8.0），0.1% SDS，0.05%過硫酸銨，0.05%四甲基乙二胺）。每塊膠體恒流4.5 mA電泳20 h至電泳結束［20］。肌聯蛋白膠體采用改進型考馬斯亮藍染色和脫色［21］。肌鈣蛋白-T的聚丙烯酰胺變性凝膠電泳采用濃縮膠濃度4%、分離膠濃度10%的蛋白預制膠。恒壓80 V電泳30 min后，調整電壓為120 V至溴酚藍標記跑至膠體底部，電泳結束［22］。取出肌鈣蛋白-T的膠體通過濕法轉印技術將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上［23］。轉印條件為恒壓70 V，轉印70 min。轉印完成后將聚偏氟乙烯膜正面放入含有5%牛血清白蛋白的TBST（20 mmol·L-1Tris-base，137 mmol·L-1氯化鈉，5 mmol·L-1氯化鉀，0.05%吐溫20）溶解液中，室溫封閉2 h。肌鈣蛋白-T抗體（1∶500）4℃繼續孵育16 h。TBST反復漂洗（5 min，6次）后將聚偏氟乙烯膜置于HRP標記二抗（1∶500）中，室溫反應2 h。TBST反復漂洗（5 min，6次），膜表面滴加化學顯色劑ECL，暗箱反應6 min后終止反應，凝膠成像儀掃描并拍照。蛋白免疫印記條帶采用Quanity one分析軟件進行半定量分析。

1.4數據分析

數據采用SAS 8.1統計軟件進行方差分析，并通過Duncan's法比較處理組間差異，差異顯著性水平為P＜0.05，數據以均值±標準差（means±SD，n=6）表示。

2　結果

2.1高氧氣調包裝對豬肉羰基含量及肌細胞內分布的影響

圖1結果顯示，貯藏第1天處理組間羰基含量無顯著差異（P＞0.05），貯藏第4天和第6天，高氧氣調包裝組羰基含量顯著高于真空包裝組（P＜0.05）。

激光共聚焦顯微鏡觀察結果見圖2，其中陰性對照組肌細胞形態比較規則，胞膜完整，細胞飽滿，細胞間隙致密，無熒光著色。圖示紅色熒光信號部分即特異性結合的氧化羰基。高氧氣調包裝組和真空包裝組熒光信號在貯藏期間均呈現動態變化。宰后貯藏第1天，高氧氣調包裝組視野下部分肌細胞外周近胞膜處出現氧化熒光信號，熒光分布不均勻。宰后貯藏第4天，高氧氣調包裝組熒光多分布于細胞膜邊緣，以細胞靠膜處密度更高，逐漸向胞內擴散呈暗紅色。真空包裝組熒光分布于細胞膜包圍的很小區域，熒光信號較弱。宰后貯藏第6天，高氧氣調包裝組肌細胞外周呈高亮熒光圈，細胞內部熒光信號增強。肌細胞間熒光信號分布基本均勻。此外，相對于高氧氣調包裝組，真空包裝組熒光信號較弱，分布多集中在細胞膜周圍，且肌細胞變形嚴重，肌細胞形態出現脫水、皺縮，骨架結構坍塌，細胞間裂隙變大。

圖1　高氧氣調包裝對宰后貯藏期間豬肉羰基含量的影響Fig. 1　Effects of HiOx on carbonyl content of pork during postmortem refrigerated storage

圖2　高氧氣調包裝和真空包裝豬肉肌細胞內羰基分布的免疫熒光顯微圖Fig. 2　Fluorescence microscopic images showing protein carbonyl distribution from pork longissimus dorsi muscle in HiOx and VP during postmortem refrigerated storage

2.2高氧氣調包裝對豬肉活性巰基含量的影響

由圖3可知，宰后貯藏期間高氧氣調包裝組的活性巰基含量均低于真空包裝組。在貯藏第6天，高氧氣調包裝組活性巰基含量與真空包裝組差異顯著（P＜0.05）。

圖3　高氧氣調包裝對宰后豬肉活性巰基含量的影響Fig. 3　Effects of HiOx on free sulfhydryl content of pork during postmortem refrigerated storage

2.3高氧氣調包裝對豬肉肌節的影響

由圖4可知，高氧氣調包裝和真空包裝組肌原纖維超微結構在宰后貯藏期間均發生顯著變化。宰后貯藏第1天，高氧氣調包裝組和真空包裝組A帶和I帶清晰可辨，Z線和M線均保持完整，肌原纖維之間連接緊密，處理組間無明顯差異。宰后貯藏第4天，相對于高氧氣調包裝組，真空包裝組Z線附近發生較為明顯斷裂，Z線周圍的細絲與Z線的連接開始弱化，M線也出現弱化。宰后貯藏第6天，真空包裝相對于高氧氣調包裝，大量肌節出現Z線的裂解，肌節分裂成細絲狀，A帶模糊，M線基本消失，肌節結構遭到破壞。肌節形態學結果表明，高氧氣調包裝抑制了宰后豬肉成熟過程。

圖4　高氧氣調包裝和真空包裝宰后豬肉肌節變化的透射電鏡圖Fig. 4　Transmission electron micrographs showing sarcomere changes of pork longissimus dorsi muscle in HiOx and VP during postmortem refrigerated storage

2.4高氧氣調包裝對豬肉鈣蛋白酶活性的影響

從圖5和表1可知，高氧氣調包裝組在宰后貯藏第1天μ-鈣蛋白酶條帶相對光密度值顯著高于真空包裝組（P＜0.05），即相對于真空包裝組，高氧氣調包裝組μ-鈣蛋白酶活性顯著低于真空包裝組（P＜0.05），高氧氣調包裝組豬肉在宰后早期μ-鈣蛋白酶活力的發揮受到抑制。

2.5高氧氣調包裝對豬肉蛋白質降解的影響

2.5.1高氧氣調包裝對豬肉肌聯蛋白降解的影響由圖6和表2可知，在宰后貯藏1 d，高氧氣調包裝組和真空包裝組降解條帶含量沒有明顯差異（P＞0.05）。在宰后貯藏第4和6天，真空包裝組肌聯蛋白降解條帶含量顯著低于高氧氣調包裝組（P＜0.05），即高氧氣調包裝組抑制了宰后豬肉肌聯蛋白的降解。

圖5　高氧氣調包裝對貯藏1天豬肉鈣蛋白酶活性的影響Fig. 5　Effects of HiOx on calpain activity at 1 d of postmortem refrigerated storage

表1　高氧氣調包裝和真空包裝豬肉宰后貯藏第1天鈣蛋白酶活性Table 1　μ-Calpain activity of pork in HiOx and VP at 1 d of postmortem refrigerated storage

圖6　高氧氣調包裝對豬肉肌聯蛋白降解的影響Fig. 6　Effects of HiOx on degradation of titin at 1， 4 and 6 d of postmortem refrigerated storage

表2　高氧氣調包裝和真空包裝豬肉肌聯蛋白蛋白質降解的變化Table 2　Changes of degraded titin of pork in HiOx and VP

2.5.2高氧氣調包裝對豬肉肌鈣蛋白-T降解的影響由圖7和表3可知，在貯藏第4天和第6天，高氧氣調包裝組中肌鈣蛋白-T 30 kDa降解產物含量顯著低于真空包裝組（P＜0.05），而貯藏第1天，高氧氣調包裝對肌鈣蛋白-T 30 kDa的降解產物含量并無顯著影響（P＞0.05）。

圖7　高氧氣調包裝對宰后豬肉貯藏期間肌鈣蛋白-T降解的影響Fig. 7　Effects of HiOx on degradation of troponin-T at 1， 4 and 6 d of postmortem refrigerated storage

表3　高氧氣調包裝和真空包裝豬肉肌鈣蛋白-T的降解變化Table 3　Changes of degraded troponin-T of pork in HiOx and VP

3　討論

蛋白質氧化指由氧分壓產生的活性氧（ROS）與蛋白質反應導致蛋白共價修飾［24］。肌肉蛋白質在ROS作用下，某些特定氧基酸殘基發生反應，導致蛋白質結構變化，使得蛋白質與氧化物親和力加強，易于產生水解、交聯、聚合，從而損害肌細胞功能［25］。蛋白質氧化損傷反應涉及蛋白質羰基的產生，羰基生成是一個復雜的過程。STADTMAN［26］認為羰基生成是由活性氧攻擊氨基酸自由氨基或亞氨基，經反應最終生成NH3和相應羰基衍生物。另外，ROS所致蛋白質肽鏈斷裂，在斷裂處也可產生羰基。ZAKTYS-WALIWANDER等［22］發現高氧氣調包裝的牛肉在4℃貯藏8 d和14 d的羰基含量均顯著高于真空包裝組，同時蛋白質氧化能夠抑制牛肉的嫩化。DELLES等［27］同樣發現高氧氣調包裝相對于真空包裝和透氧包裝，顯著增加了豬肉蛋白質羰基含量，且證實了蛋白質氧化是解釋宰后豬肉較差持水力的原因之一。這與本研究結果一致，由羰基含量反映的肽鏈、氨基酸結構和功能的改變、蛋白質氧化程度增加提示了影響宰后成熟肉品質的可能原因。ASTRUC等［16］認為，相對于通過羰基含量評價蛋白質氧化程度，通過激光共聚焦顯微鏡觀察羰基在肌細胞內的熒光分布，更能清楚地了解肌細胞氧化通路的動態變化。本試驗中，高氧氣調包裝組比真空包裝組較先出現蛋白質氧化，且氧化熒光信號集中于肌細胞膜邊緣，逐漸向細胞內部擴散，肌細胞間熒光信號分布相對均勻。ASTRUC［16］試驗發現宰后動物體內蛋白質氧化起始于細胞膜；這主要因為細胞膜是磷脂雙分子層，其富含的多不飽和脂肪酸（可保持細胞膜的相對流動性以保證細胞正常生理功能）極易被氧化，膜上蛋白質又因接近磷脂雙分子層，由脂肪氧化形成的羥自由基能夠奪取蛋白質分子的氫離子，使得細胞膜上蛋白質開始了與脂肪氧化類似的自由基鏈式反應［28］。ROS從肌細胞膜向細胞內部傳遞的過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白逐漸氧化。

巰基是蛋白質殘基中最具有反應活性的基團，極易被氧化為二硫鍵、次磺酸、亞磺酸及磺酸，或被一氧化氮亞硝基化。LUND等［6］通過對肌球蛋白的重鏈進行一維電泳時發現，蛋白質分子間通過二硫鍵交聯、聚集，是巰基含量降低的主要原因之一。此外，目前已鑒定了一大批易受氧化還原調控的蛋白質，其活性部位均含有巰基基團，通過對巰基的修飾可以顯著改變細胞內的信號轉導［29-30］。HUFF-LONERGAN等［8］報道，鈣蛋白酶通過降解對細胞有序性和完整性十分重要的肌原纖維蛋白和細胞骨架蛋白從而調控牛肉嫩度和豬肉的保水性。然而鈣蛋白酶活性區域的巰基極易被氧化形成二硫鍵，導致鈣激活酶失活，底物肌原纖維蛋白降解受到抑制，肌肉細胞的有序性和完整性遭到破壞。因此，蛋白質巰基完全可以作為影響細胞內氧化還原信號轉導過程的更直接、更相關的“探針”。本研究發現，由活性巰基含量降低反映的高氧氣調包裝下氧化程度增加，與羰基的結果相一致。

在宰后成熟過程中，蛋白質氧化反應主要包括肌原纖維蛋白和相關酶系統氧化，這些氧化都是通過改變肌原纖維的降解從而影響肉品品質。其中，鈣蛋白酶能夠調控肌原纖維蛋白以及一些肌肉骨架蛋白的降解，例如肌聯蛋白、伴肌動蛋白、肌鈣蛋白-T、整聯蛋白、肌間線蛋白等［31］。目前普遍認為肉類在宰后成熟過程中成熟品質的改善主要歸功于這些蛋白質的降解。有關鈣蛋白酶系統動力學研究發現，氧化能改變宰后動物體內的離子水平，使得鈣蛋白酶活性改變，從而導致底物降解情況發生改變［10］。此外，鈣蛋白酶活性的發揮必須保證其活性區域還原性。LAMETSCH等［12］發現μ-鈣蛋白酶半胱氨酸活性區域對氧化環境十分敏感，鈣激活酶肽段殘基92—114間存在二級結構螺旋，其可伸展性縮短Cys 108與Cys 115空間距離，從而為活性區域Cys 108和Cys 115之間形成二硫鍵提供可能，導致鈣蛋白酶活性喪失。本研究表明，由羰基含量及分布、巰基含量、肌節變化反映的蛋白質氧化增加，鈣蛋白酶活性區域極易受到氧化攻擊，蛋白質結構破壞，從而抑制了鈣蛋白酶功能活性發揮。

μ-鈣蛋白酶活力可以預測宰后成熟過程中肌原纖維蛋白以及肌肉骨架蛋白的降解［9，11，31］。不論是μ-鈣蛋白酶被氧化還是其底物蛋白被氧化，均會對肉類宰后成熟品質產生影響。肌聯蛋白（titin）是肌細胞骨架蛋白中含量最多且分子量最大的蛋白，位于M線和Z線之間，其C末端與M線相接，N末端是Z線的組成部分，幾乎橫跨了半個肌節［20，32］。titin將粗絲維持在肌節的中央，具有保持粗絲穩定、調節粗絲收縮、保持肌節及肌細胞完整性等功能。肌鈣蛋白-T（troponin-T）是肌鈣蛋白和原肌球蛋白相結合亞基，對鈣離子具有較高的敏感性，它能與原肌球蛋白結合調節橫紋肌的收縮。肌肉宰后成熟過程中，troponin-T由分子量35 kDa產生28—30 kDa的特征降解產物。目前，troponin-T的降解特征產物已作為預測肉品成熟品質的重要指標之一［33］。FU等［34］報道，高氧氣調包裝的宰后成熟第4—7天，牛肉的μ-鈣蛋白酶活性顯著低于真空包裝和透氧包裝組，且troponin-T的降解受到抑制。本試驗也證實高氧氣調包裝能夠通過抑制宰后豬肉早期μ-鈣蛋白酶活性的發揮，對troponin-T和titin在宰后貯藏第4天和第6天的降解具有顯著抑制作用。肌原纖維蛋白降解弱化一定程度上也解釋了高氧氣調包裝下宰后肌節超微形態的改變。肌節是組成肌原纖維的基本單位，高氧氣調包裝能夠抑制豬肉肌原纖維蛋白及細胞骨架蛋白的降解，體現在連接Z線和M線的titin降解產物變少，構成骨骼肌完整細絲的troponin-T降解弱化，進而抑制Z線附近斷裂，維持Z線周圍細絲與Z線間的連接，阻礙肌原纖維經宰后成熟過程中的小片化，保持肌節結構的相對完整性。

4　結論

高氧氣調包裝能夠增加宰后豬肉羰基含量，擴大羰基在肌細胞內分布，降低活性巰基含量，加劇宰后豬肉蛋白質氧化。同時高氧氣調包裝具有抑制早期μ-鈣蛋白酶活性發揮，抑制肌聯蛋白和肌鈣蛋白-T等關鍵肌原纖維蛋白的降解，阻礙宰后豬肉肌節成熟的作用。

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（責任編輯趙伶俐）

Effects of High Oxygen Modified Atmosphere Packaging on Protein Oxidation， Calpain Activity and Protein Proteolysis of Pork During Postmortem Refrigerated Storage

CHEN Lin， ZHOU Guang-hong， XU Xing-lian， ZHANG Wan-gang
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Meat Processing and Food Control，Ministry of Education/Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition， Nanjing 210095）

【Objective】 The objective of this study was to investigate the effect of high oxygen modified atmosphere packaging（HiOx， 80% O2/20% CO2）on protein oxidation， calpain activity and protein proteolysis of pork during refrigerated storage. This could help explaining the mechanism of regulation behind HiOx in pork quality. 【Method】 Twelve Longissimus dorsi muscles of Duroc × Landrace × Yorkshire crossbred pork were precooled at 4℃ for 24 h， and then randomly assigned to either HiOx or vacuum packaging （VP） and stored for 1， 4 and 6 d at 4℃. The carbonyl content and distribution， sulfhydryl content， sarcomere changes，calpain activity， titin and troponin-T degradation were determined， respectively. 【Result】 Carbonyl content of samples from HiOx was significantly higher than the samples from VP at 4 and 6 d of storage （P＜0.05）. HiOx samples showed fluorescence signal in the peripheral area of cell membrane and then the fluorescence signal spread to the internal cellular environment at 1 and 4 d of postmortem refrigerated storage. At 6 d of postmortem refrigerated storage， samples under HiOx presented a strong fluorescencelight， with a glaring fluorescence intensity more pronounced in a peripheral area corresponding to the cell membrane and to a region in close contact with the cell membrane， while VP samples presented weaker fluorescence signal. Sulfhydryl content of HiOx samples was significantly lower compared with VP samples at 6 d of postmortem storage （P＜0.05）. Samples from VP showed weakening M line， blurry A band as well as broken Z line during postmortem refrigerated storage， whereas samples under HiOx remained less affected. μ-Calpain activity was less in samples from HiOx compared with that from VP at 1 d of storage （P＜0.05）. Titin and troponin-T showed less proteolysis in samples from HiOx than that from VP at 4 and 6 d of postmortem refrigerated storage（P＜0.05）. 【Conclusion】 Increased protein oxidation under HiOx could inhibit μ-calpain activity and protein proteolysis of pork during postmortem refrigerated storage.

pork； high oxygen modified atmosphere packaging； vacuum packaging； protein oxidation； calpain activity； protein proteolysis

2016-01-25；接受日期：2016-04-07

“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD28B03）、國家自然科學基金（31271899）

聯系方式：陳琳，E-mail：njauchenlin@163.com。通信作者張萬剛，E-mail：wangang.zhang@njau.edu.cn