寡糖·鏈蛋白對小麥抗黃花葉病毒的免疫誘抗作用

徐潤東，盛世英，楊秀芬，劉　勇

（1山東農業大學植物保護學院，山東泰安 271018；2中國農業科學院植物保護研究所，北京 100081）

寡糖·鏈蛋白對小麥抗黃花葉病毒的免疫誘抗作用

徐潤東1，盛世英2，楊秀芬2，劉勇1

（1山東農業大學植物保護學院，山東泰安 271018；2中國農業科學院植物保護研究所，北京 100081）

【目的】激發子可以誘導寄主植物的系統獲得抗病性，具有有效性、持久性和廣譜性的特點。研究旨在明確新型激發子寡糖·鏈蛋白（oligosaccharins·plant activator protein）對小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）的免疫誘抗作用，為該激發子的研究和大面積推廣應用提供技術支撐。【方法】選用小麥黃花葉病感病品種‘矮抗58’，在室內將消毒的小麥種子播種于自感病田帶回的病土中，在（27±2）℃下培養。5葉期葉面噴施稀釋1 000倍的6%寡糖·鏈蛋白。噴施7 d后，將麥苗置于（12±1）℃培養箱中接種培養。30 d后取出麥苗，分別測量小麥株高和葉片的葉綠素含量，計算病情指數和防治效果。在田間，同品種小麥種植于小麥黃花葉病常發地塊，小麥返青后每周噴施1次6%寡糖·鏈蛋白，連續噴施3次。每周測量小麥株高和葉綠素含量，計算病情指數和防治效果。并于調查期間，每小區取20片植株最上部第一片完全展開的葉片，通過qPCR檢測小麥植株內WYMV-CP基因拷貝數。在小麥收獲時測定千粒重和穗粒數，測算產量。【結果】低溫培養30 d后，經寡糖·鏈蛋白噴施處理的小麥較對照組的株高沒有顯著差異，但葉綠素含量則明顯高于對照組（P＜0.05）；同時處理組的病情指數較對照組明顯降低，防治效果達到63.32%。田間經寡糖·鏈蛋白處理后，小麥株高和葉綠素含量較對照沒有顯著差異。小麥返青期，噴施1周后病情指數與對照沒有顯著變化；而2周后病情指數顯著降低，防治效果可達46.67%。小麥收獲時調查發現，經寡糖·鏈蛋白處理后小麥穗粒數顯著高于對照組（P＜0.05），小麥產量明顯升高（P＜0.05）。病株內WYMY-CP基因拷貝數在噴施1周后抑制率達到69.30%，2周后達到85.50%，3周后最高達到99.20%。【結論】寡糖·鏈蛋白可誘導小麥植株對小麥黃花葉病毒的抗性，顯著降低小麥植株內WYMV-CP基因拷貝數；在田間可以減輕小麥黃花葉病的危害，減少產量損失。

小麥黃花葉病毒；寡糖·鏈蛋白；誘導抗性；激發子；WYMV-CP

0　引言

【研究意義】小麥是中國最重要的糧食作物之一，近年來，小麥黃花葉病在中國局部地區呈發展蔓延趨勢，嚴重影響小麥生產。小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）屬馬鈴薯Y 病毒科（Potyviridae），大麥黃花葉病毒屬（Bymouirus），是由禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）傳播的彎曲線狀病毒。田間癥狀為葉片黃化、退綠，嚴重時植株矮小，分蘗減少，引起小麥品質和產量下降［1］。自1990年以來，該病在陜西、四川、湖北、山東、河南、安徽、江蘇和浙江等省發生嚴重，并隨著全球變暖逐漸向北蔓延，目前在中國每年發生面積為66.7萬hm2左右，感病田塊一般減產10%—30%，重病區減產嚴重時達到70%以上。因而研發小麥黃花葉病的控制方法和技術具有重要意義［2］。【前人研究進展】小麥黃花葉病最早于1927年在日本發現并被描述，19世紀60年代該病在中國四川首次被報道［3］。小麥黃花葉病在小麥越冬期病毒呈休眠狀態，小麥返青前后開始表現癥狀，拔節期危害最重，氣溫升至20℃后，花葉癥狀逐漸消失，出現隱癥［3-5］。病毒主要依靠病土、病根殘體、病田流水中的帶毒禾谷多黏菌休眠孢子進行傳播；也可以通過混雜在種子里的帶毒土壤進行遠距離傳播。發病嚴重時，會造成田間帶毒禾谷多黏菌休眠孢子大量積累，導致病毒蔓延加速，引起病害流行，危害嚴重。由于該病毒存在于禾谷多黏菌休眠孢子體內，而禾谷多黏菌休眠孢子堆壁厚，具有很強的抗逆性，很難用化學方法防治［6］。因而在實際生產中，采用抗病品種是最經濟和有效的措施。雖然抗病品種在生產中可以發揮一定的作用，但由于小麥品種資源中小麥土傳病毒的抗源有限，小麥土傳病毒病的防治一直是生產中的一個難題［7-8］。而且，目前也尚無以基因修飾法培育抗黃花葉病小麥新品種的成功案例。自1901年RAY用接種銹菌的弱毒小種來抵抗銹病病菌侵染以來，研究者發現在一定條件下，一些物質可以激發或誘導植物的抗性，繼而在這一領域的研究有了長足的進展。如發現了一系列能夠誘導植物產生抗性的生物和非生物因子［9］。目前將這類能夠刺激植物產生防衛反應的物質統稱為激發子（activator）［10］。大多數激發子在提高作物抗逆性以及抵御有害生物危害上具有潛在的應用價值。如苯并噻二唑（BTH）、β-氨基丁酸（BABA）、2，6-二氯異煙酸（INA）等都可以誘導植物的抗性，并且對多種植物細菌、真菌和病毒的侵染具有一定的抗性［11-16］。寡糖·鏈蛋白是基于極細鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）中分離的蛋白激發子PeaT1（GenBank登錄號EF030819）和Hrip1（GenBank登錄號HQ713431）而研制的蛋白質生物農藥。PeaT1在大腸桿菌中的表達產物能提高植物體內相關防衛基因的表達，誘導抗逆性產生，提高作物的產量與品質［17-18］。Hrip1能改善和提高植株的耐鹽抗旱能力［19］。目前在防治煙草和水稻病毒病害上效果明顯［20-23］。【本研究切入點】針對小麥黃花葉病難以有效控制的客觀現實，而且使用激發子誘導植物抗性來防治病毒病在國內外已有成功案例。【擬解決的關鍵問題】通過試驗室內和田間在小麥黃花葉病病株上噴施寡糖·鏈蛋白，并分析其對小麥植株抵御黃花葉病病毒侵染的免疫誘抗作用，以期為有效控制小麥黃花葉病提供新途徑和科學依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試小麥小麥品種為小麥黃花葉病感病品種‘矮抗58’。

1.1.2主要試劑6%寡糖·鏈蛋白由中國農業科學院植物保護研究所蛋白質農業研究組提供。RNA提取試劑盒為全式金RNA提取試劑盒ER301-01。

1.2室內試驗設計及調查和評價方法

1.2.1試驗設計與處理每盆（內徑20 cm）40粒小麥種子播種于試驗田取回的病土中，溫度（27±2）℃，光周期L∶D=16 h∶8 h，5葉期植株用于試驗。由于小麥黃花葉病毒為土傳真菌介導傳播，病毒本身為線狀粒子容易斷裂，病毒外殼蛋白極不穩定，采用機械接種比較困難且效率極低，故本試驗采用低溫條件下的土傳接種［24］。以1 000倍6%寡糖·鏈蛋白葉面噴施，清水為對照。3 d后，置于（12±1）℃，光周期L∶D=12 h∶12 h條件下的培養箱中低溫接種［24］。重復3次。

1.2.2調查和評價方法上述小麥在培養箱內生長30 d后取出，分別調查小麥植株的發病級別，并測量株高和葉綠素含量。病情分級標準如下：0級：無癥狀；1級：新葉出現退綠條紋或黃化癥狀；2級：多數葉片出現退綠條紋或黃化癥狀，有時會出現新葉扭曲，植株矮化不明顯；3級：全株呈現嚴重花葉癥狀，老葉上出現壞死斑，植株明顯矮化，部分分蘗死亡或者全株死亡［8］。小麥的葉綠素含量以AWOS_YL01葉片參數儀，取小麥最上部第1片完全展開的葉測定［25］。病情指數和防治效果計算公式如下：

1.3田間試驗設計及調查和評價方法

1.3.1田間試驗設計田間試驗自2014年10月至2015年6月在山東省泰安市徐家樓（117°09′E， 36°09′N）進行。試驗地多年以冬小麥-玉米的種植模式，地塊平整，水肥條件一致，小麥黃花葉病發病均勻且嚴重，而且沒有采取任何防控措施。田間試驗設對照區和寡糖·鏈蛋白處理區。小區完全隨機設計，重復3次。小區面積為10 m×10 m，間隔2 m。分別于2015年小麥返青后（3月13日、3月19日和3月30日）噴施（100 g/667 m2），共噴施3次。噴施量為參照在其他作物中的試驗使用量確定，播種及生長期間管理措施一致，小麥生長期間不使用任何化學農藥［21-23］。

1.3.2調查和評價方法自2015年3月13日開始，每7 d按雙對角線5點取樣法，每小區取小麥30株，調查發病級別。發病分級及病情指數和防治效果計算同1.2.2。2015年3月30日后，小麥黃花葉病開始隱癥，以同樣的方法每小區取30株小麥測量植株的株高和葉綠素含量。小麥收獲時，仍以雙對角線5點取樣法，每小區取麥穗50個，剝查穗粒數，并以GB/T5519-88標準測定千粒重并以穗粒數和千粒重進行產量測算［26］。

1.4小麥葉片總RNA的提取與WYMV-CP在小麥體內蓄積量檢測

1.4.1小麥葉片總RNA的提取自3月19日開始，每7 d按雙對角線5點取樣法，每小區取植株最上部第一片完全展開的葉片20片，帶回實驗室置于-80℃冰箱中保存，用以提取總RNA，檢測WYMV-CP基因拷貝數。植物RNA提取參照試劑盒說明書進行。測定各樣品的A260和A260/A280值來計算RNA濃度和估計總RNA的純度。RNA的完整性通過在1%瓊脂糖凝膠電泳來評估。

1.4.2引物設計根據NCBI核酸數據庫中的WYMV-CP基因序列，利用引物設計軟件Primers 5.0設計WYMV-CP引物F：5′-GCAGAAAACCAGA CCATGCA-3′和R：5′-TTCATCACTGTAGGCTCGCA -3′。

1.4.3標準曲線的制作帶有WYMV-CP的質粒（中國農業大學韓成貴教授惠贈）起始濃度為500 ng·μL-1。將帶有基因的質粒標準品進行10倍系列梯度稀釋，熒光定量PCR體系中加入標準品1 μL，每個濃度設置3個重復。熒光定量PCR儀（型號為Biorad IQ5）能自動生成基因拷貝數與Ct值的標準曲線。

1.4.4熒光定量PCR檢測小麥葉片中的WYMV-CP含量分別取各樣品相同量的總RNA，以RNA為模板在熒光定量PCR儀上進行熒光定量RT-PCR擴增，反應體系為10 μL，PCR程序：45℃ 30 min；95℃ 10 min；然后95℃變性15 s，60℃退火并延伸1 min，44個循環。把樣品加入同一塊96孔板中，設置3個重復。PCR擴增結束后，根據每個樣品的Ct值以及標準曲線方程式進行定量分析。

1.5統計方法

小麥株高、葉綠素含量、穗粒數和千粒重的差異性比較采用SPSS 16.0的獨立樣本T檢驗（Independent samples T test）分析。

2　結果

2.1室內寡糖·鏈蛋白處理后小麥的植株特征、病情

指數和防治效果

低溫培養30 d后，盡管經寡糖·鏈蛋白噴施處理的小麥較對照組的株高沒有顯著差異，而葉綠素含量則明顯高于對照組（P＜0.05）。同時處理組的病情指數較對照組明顯降低，防治效果達到63.32%（表1）。

表1　室內寡糖·鏈蛋白處理對小麥株高、葉綠素含量、病情指數的影響及防治效果Table 1　Effects of oligosaccharins·plant activator protein on wheat height， chlorophyll content and disease reduction of WYMV in laboratory

2.2寡糖·鏈蛋白處理對田間病毒病發生的影響

田間處理中，3月12日部分小麥開始表現出輕微黃化癥狀，3月19日小麥植株全部出現黃化癥狀，部分出現重度黃花和矮化癥狀，3月30由于氣溫回升，部分癥狀消失，4月8日則完全隱癥。由表2可知，在經小麥返青后噴施寡糖·鏈蛋白，至3月30日，處理區的病情指數明顯下降，防治效果達到46.67%。

2.3寡糖·鏈蛋白處理的小麥葉片中病毒外殼蛋白基因的積累

免疫蛋白處理小麥葉片后的不同待檢樣品與標準品在相同條件進行qRT-PCR檢測，得到的Ct值根據標準曲線線性方程計算出不同樣品中外殼蛋白基因的蓄積量。測定結果表明，寡糖鏈蛋白的樣品標準曲線為y= -3.239x+6.696（圖1），其中y為Ct值，x為lgCo，Co為WYMV外殼蛋白起始濃度。由表3可以得知，小麥植株在田間經寡糖·鏈蛋白處理7 d后，WYMV-CP的復制得到明顯抑制，抑制率達到了69.30%，并且在此后的14 d內表現持續的抑制作用（3月30日：抑制率85.50%；4月8日，抑制率99.20%）。

2.4田間寡糖·鏈蛋白處理對小麥穗粒數及產量的影響

田間調查期間，盡管對照組和處理組的株高和葉綠素含量均沒有顯著差異，但從圖2得知，經過寡糖·鏈蛋白處理的小麥穗粒數較對照組明顯增高（P＜0.05），而千粒重沒有明顯變化。在最后的產量測定中經寡糖·鏈蛋白處理的小麥產量較對照組明顯增高。

表2 田間寡糖·鏈蛋白處理對小麥株高、葉綠素含量、病情指數的影響及防治效果Table 2　Effects of oligosaccharins·plant activator protein on wheat height， chlorophyll content and disease index and its efficacy in control WYMV in field

圖1　攜帶WYMV-CP標準品的標準曲線Fig. 1　Standard curve of quantitative real-time PCR for WYMV-CP

表3　寡糖·鏈蛋白誘導后對小麥葉片WYMV-CP基因拷貝數的影響Table 3　WYMV-CP gene copies with or without oligosaccharins·plant activator protein treatment

圖2　寡糖·鏈蛋白對小麥黃花葉病病株的穗粒數、千粒重和產量的影響Fig. 2　Effects of oligosaccharins·plant activator protein on seeds per ear， thousand grain weight and yields of wheat infected by WYMV

3　討論

植物通過復雜的調節網絡系統抵御外界不良因子的侵襲，這是植物防衛反應所特有的。多酚氧化物酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物形成多種次生代謝產物的關鍵酶，這些代謝產物有限制病原生長和抗菌的功能［27］。同時病程相關基因（pathogenesis-related genes，PRs）的表達上調，在植物的誘導抗病反應中發揮重要作用。PR基因最初發現主要是由于它們在植物受到病原菌侵染時會大量表達，目前，在所有植物中幾乎都有PR基因的報道［28-29］。大量證據表明，PR基因在植物抗病反應中不僅發揮作用，而且也是不同植物系統獲得抗性（system acquired resistance，SAR）啟動表達的重要防衛反應標志基因［30-33］。用寡糖·鏈蛋白誘導煙草對TMV抗性時發現，經誘導的植株PPO、POD和PAL酶活增高［32］。同時用寡糖·鏈蛋白處理小麥植株后，小麥植株體內的PR1、PR2、PR5的表達量在12—24 h內均有大幅度上調（未發表資料）。所以筆者推測寡糖·鏈蛋白誘導小麥產生了對WYMV的系統獲得抗病性。

對于禾谷多黏菌傳播的小麥黃花葉病，該病發生的最適溫度為15℃，變動范圍為5—17℃，一旦溫度超過20℃就會發生隱癥，很難從外觀準確判斷病狀。同時小麥黃花葉病發病時會伴隨一定的植株矮化和葉片黃花［7-8］。所以本試驗在調查病情等級時，也同時調查了小麥植株株高和葉片葉綠素含量，用此作為輔助參數。結果表明在實驗室內，對照組小麥植株發病嚴重時，葉綠素含量明顯低于處理組（P＜0.05）。盡管田間對照組與處理組相比小麥葉綠素含量沒有顯著差異，但也有所降低。這表明，對于小麥黃花葉病的發病程度，可以通過植株的葉綠素含量來評價。

田間施用寡糖·鏈蛋白后，處理植株WYMV-CP基因拷貝數明顯受到抑制，穗粒數顯著增加。并且防治效果可達46.67%，說明寡糖·鏈蛋白可以通過抑制WYMV病毒的復制，而減輕病害的發生，提高產量。

激發子誘導植物對病原菌的抗性具有時滯性。間隔期因不同植物和不同誘導子而異。如菜豆（Phaseolus vulgaris）在接種非病原菌Colletotrichum lindemuthianum 24—36 h后顯示出對Helminthosporium carbonum和Alternaria sp.的過敏反應［34-35］。從表3可以得知，寡糖·鏈蛋白在田間處理小麥植株7 d后（2015年3月19日），WYMV-CP基因拷貝數就明顯受到抑制，抑制率達到69.30%，但在田間病情等級調查中沒有發現明顯的防治效果。直到2周后（2015年3月30日），外在癥狀上才表現出對小麥黃花葉病的明顯抗性，防治效果為46.67%。同時，植物的誘導抗性只能使植株對病原菌表現出相對的抗性，減輕病原菌對寄主植物的侵染程度［36］。在誘導抗性的持久性上，經誘導的植物并不能永久保持這種因誘導而產生的抗性，通常會隨著誘導處理時間的延長抗性會減弱［37］。另外，根據小麥黃花葉病自身的發病規律及其與溫度的關系，建議在小麥黃花葉病發病的最適溫度前2周噴施。

相對于穩定的室內環境，田間植株要面臨更多的生物和非生物因子的脅迫［38］。田間的小麥植株，在無防控措施的條件下，除受到小麥黃花葉病的侵染，也可能遭受其他有害生物的危害。干旱等非生物因子的脅迫也時有發生。這些生物及非生物因子對激發子的誘抗作用及防治效果都可能產生不利影響。寡糖·鏈蛋白在實驗室內對于小麥黃花葉病的防治效果好于田間試驗（表1、表2），可能是由于田間復雜的生物及非生物因子的影響所致。

由于植株缺乏與動物類似的免疫系統，一旦被病毒感染就處于終生受害狀態。目前仍沒有有效的治療植物病毒的藥劑［37］。通過激發子誘導植物的抗性是抵抗植物病毒侵害的重要手段，國際上已經有部分激發子上市，用于控制病毒病的危害［11-13］。激發子不會對病原菌產生選擇壓力，不易產生抗藥性，而且還具有抗非生物脅迫和促進作物生長的特點，因此，激發子生物農藥是經濟、安全高效的綠色防控新產品。盡管目前對激發子的作用機理尚需深入研究，但不可否認，激發子如寡糖·鏈蛋白在病害防治、提高作物抗逆性等方面可能具有廣闊的應用前景。

4　結論

寡糖·鏈蛋白可誘導小麥植株產生對小麥黃花葉病的抗性，降低病情指數，提高小麥穗粒數，增加產量。其作用機理可能與顯著抑制小麥體內WYMV-CP基因拷貝數有關。在小麥黃花葉病的常發地塊，可以在小麥返青前2周左右噴施寡糖·鏈蛋白，通過增強植株的抗性，抵御病害，減少產量損失。

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（責任編輯岳梅）

Effect of Induced Resistance of Oligosaccharins·Plant Activator Protein on Wheat to WYMV

XU Run-dong1， SHENG Shi-ying2， YANG Xiu-fen2， LIU Yong1
（1College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， Shandong；2Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081）

【Objective】Plant activator could trigger effective， persistent and broad-spectrum resistance in plants. The objective of this experiment is to study the resistance induced by oligosaccharins·plant activator protein against Wheat yellow mosaic virus（WYMV）， thus providing a technical basis for the research and promotion of the use of activator proteins on a large scale.【Method】In laboratory， WYMV susceptible wheat cultivar ‘Aikang 58' was sowed in the soil that was collected from the WYMV infested field and grown in the incubator under （27±2）℃. When the wheat grown up to five-leaf stage， the 6% oligosaccharins·plant activator protein that was diluted 1 000 times was sprayed. After 7 days， the wheat was put in incubator for 30 days under （12±1）℃， so as to get WYMV inoculated plants. Then the height of wheat plant， chlorophyll content， disease index， and control efficiency weremeasured or calculated. In filed， wheat was sowed in the plot that infested with WYMV for many years. The oligosaccharins·plant activator protein was sprayed once a week for successive three times of spray when wheat plant was at returning green stage. At the same time， the height of wheat plant， chlorophyll content， disease index， and control efficiency were measured or calculated. Moreover， 20 upper first fully expanded leaves in each plot were taken every week to detect the copy number of WYMV-CP by qPCR during the field investigation. The thousand grain weight， the seeds per ear and the yields were measured and calculated at harvest.【Result】The laboratory experiment showed that after 30 days of the activator spray， the chlorophyll content increased dramatically （P＜0.05）， the disease index decreased as the result of the control efficiency reached up to 63.32%， but no difference was found in plant height compared to the control. The field experiment showed that no significant control efficiency after one time spray， but the control efficiency reached up to 46.67% after two times of spray. The suppression rate of the copy number of WYMV-CP reached up to 69.30% in the first week， 85.50% in the second week， and the highest suppression reached up to 99.20% in the third week. However， the chlorophyll content and the height of wheat plants showed no significant differences. Although the seed numbers per ear significantly increased， but no difference was observed in thousand grain weight. As a result， the yields were significantly increased.【Conclusion】Oligosaccharins·plant activator protein could induce wheat plant resistance to WYMV. The copy number of WYMV-CP dramatically decreased in activator protein treated plants. It was showed that the activator could relieve WYMV damage and reduce yield loses in wheat fields.

Wheat yellow mosaic virus （WYMV）； oligosaccharins·plant activator protein； induced resistance； activator；WYMV-CP

2016-03-15；接受日期：2016-05-25

科技部國際科技合作專項（2014DFG32270）、國家公益性行業（農業）科研專項（201503130）

聯系方式：徐潤東，E-mail：aphid@sdau.edu.cn。通信作者劉勇，E-mail：liuyong@sdau.edu.cn