番茄自交系YNAU335對番茄斑萎病毒抗性的鑒定

莫云容　張培欣　鄧明華　楊正安　朱海山　張　宏　湯曉倩　文　玲　馬仲飛　趙　凱*

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南昆明 650201；2東川區(qū)經(jīng)濟作物技術(shù)推廣站，云南東川 654100；3昭通市昭陽 區(qū)園藝技術(shù)推廣所，云南昭通 657000）

番茄自交系YNAU335對番茄斑萎病毒抗性的鑒定

莫云容1張培欣1鄧明華1楊正安1朱海山1張宏1湯曉倩1文玲2馬仲飛3趙凱1*

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南昆明 650201；2東川區(qū)經(jīng)濟作物技術(shù)推廣站，云南東川 654100；3昭通市昭陽 區(qū)園藝技術(shù)推廣所，云南昭通 657000）

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）已成為近年來危害番茄生產(chǎn)的重要病害，鑒定和選育抗病品種是防治TSWV的有效途徑。選取自主培育和引進的番茄品種（系），經(jīng)過連續(xù)3 a的大棚薊馬傳毒和光照培養(yǎng)箱人工接種試驗，鑒定番茄品種（系）對TSWV的抗性。結(jié)果表明，番茄自交系YNAU335對TSWV表現(xiàn)為免疫，其他品種全部表現(xiàn)為感病，而且在YNAU335人工接種和大田薊馬傳毒葉片中并未克隆出TSWV核衣殼蛋白基因和小片段 RNA 3′ 端序列，而在其 他感病品種（系）中均克隆出這2段序列。研究結(jié)果初步確定番茄自交系YNAU335為TSWV抗病品系，可作為T SWV抗病育種的番茄資源。

番茄；番茄斑萎病毒；抗病育種；核衣殼蛋白基因；抗性鑒定

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）中最重要的一種病毒，該病毒寄主范圍廣泛，可侵染100多個科1 100多種單、雙子葉植物，而且多種茄科園藝作物為TSWV的寄主（方琦等，2011；邱樹克等，2012；孫書娥等，2014；王立浩等，2016）。澳大利亞最早發(fā)現(xiàn)TSWV，隨著傳播介體西花薊馬的擴散，TSWV在世界大多數(shù)國家傳播，并給當?shù)胤焉a(chǎn)造成嚴重損失，已被列為世界危害最大的十種植物病毒之一（張仲凱等，1998；唐前君等，2010；曹金強等，2016）。種植者試圖通過物理、化學(xué)和生物的方法控制薊馬來間接防治TSWV，但并不能有效抑制病毒的傳播（Soler et al.，2003）。目前防治TSWV經(jīng)濟、綠色、有效的方法是培育TSWV抗病品種（Gordillo & S tevens，2008）。

抗TSWV的番茄資源主要分布在秘魯番茄和智利番茄等野生番茄中，這兩類番茄對TSWV的抗性分別由不同的質(zhì)量抗病基因控制（Stevens et al.，1991；Gordillo & Stevens，2008）。利用抗病品種中質(zhì)量抗病 基因及連鎖的分子標記，國外研究者已選育出一系列T SWV抗病品種（Aramburu et al.，2010；Lopez et al.，2011）。由于抗病基因?qū)SWV有株系特異性，國外抗病品種對國內(nèi)TSWV并不一定有抗性。因此，選育適合國內(nèi)TSWV抗病品種的工作顯得迫切而重要。

1　材料與方法

1.1試驗田概況

試驗大棚位于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實驗農(nóng)場蔬持認知中心，棚內(nèi)、棚外于2013年和2014年連續(xù)兩年發(fā)生TSWV。

1.2試驗材料與試劑

供試材料為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院番茄辣椒課題組選育的品種（系）6份：5號自交系、YNAU335自交系、云雜8號、云抗1號、滇番茄23號、滇番茄26號；引自亞洲蔬持研究發(fā)展中心的自交系1份：CLN2037E。TSWV株系為YNAU2015。

RNA提取試劑盒購于北京華越洋生物科技有限公司，CDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RR047A）和PCR高保真酶PrimeSTARmaxdNA Polymerase（貨號：R045A）購于寶生物工程（大連）有限公司，克隆載體pEASY_Blunt Cloning VeCtor購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3試驗方法

1.3.1RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 番茄葉片總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說明書進行。

1.3.2RT-PCR引物設(shè)計、PCR程序、測序及序列比對 TSWV核衣殼蛋白基因全長序列克隆引物參照唐前君等（2010）合成：上游5′_ATGTCTAAGGTTAAGCTCACTAAG_3′，下游5′_TYAAGCAAGTTCTGYGAGTTTTGCC_3′。TSWV小片段 RNA 3′端序列克隆引物參照尹躍艷等（2013）合成：上游5′_ TCACTGTAATGTTCCAT AGCAA_3′，下游5′_ AGAGCAATYGTGTCAATTT TATTC_3′。PCR反應(yīng)體系：PrimeSTARmax Premix（2×）25 μL，上下游引物各1 μL，CDNA模版1 μL，加滅菌ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，72℃延伸1min，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5min。跑膠回收，連接克隆載體，篩選陽性菌落并搖菌，交于深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進行測序，最后使用MEGA 6.0構(gòu)建TSWV核衣殼蛋白基因系統(tǒng)進化樹。

1.3.3TSWV人工接種、大田薊馬傳毒及抗性評價

光照培養(yǎng)箱育苗前需充分滅菌，以保證培育的番茄苗健康，不攜帶任何病害。光照培養(yǎng)箱育苗，待幼苗長出10片真葉后，分兩批處理，一批栽至大棚填有無土基質(zhì)的水泥種植槽中，每個種植槽寬50Cm、長6m，作為一個小區(qū)，每個小區(qū)種植20株番茄，株距50Cm，行距40Cm，隨機區(qū)組排列，3次重復(fù)，自然條件下，利用大棚內(nèi)帶毒薊馬接種感?。涣硪慌鷧⒄仗魄熬龋?010）的接種方法給番茄葉片接種TSWV，每個番茄自交系選取10株，3次重復(fù)，以接種磷酸緩沖液為對照（CK）。

因目前沒有公開的TSWV病情指數(shù)調(diào)查標準，而TSWV發(fā)病葉片上有典型的黑色壞死斑點，因此本試驗參考都業(yè)娟（2013）番茄壞死條斑病的病情指數(shù)調(diào)查方法，并加以修改。分別于光照培養(yǎng)箱人工接種20d后和大田移栽30d后根據(jù)病情分級標準（表1）調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)。

發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/處理總株數(shù)）×100

病情指數(shù)=〔Σ（各級病株數(shù)×各級代表數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級數(shù)）〕×100

表1　番茄斑萎病毒病分級標準

1.3.4數(shù)據(jù)處理 運用ExCel軟件計算數(shù)據(jù)的平均值及標準偏差，并作出柱形圖；利用SPSS 10.0軟件中獨立樣本T檢驗比較各處理值與對照值差異的顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1大棚自然感病條件下番茄對TSWV的抗性鑒定

經(jīng)過連續(xù)3 a大棚自然感病鑒定，自交系YNAU335對TSWV表現(xiàn)為免疫，其他品種（系）全部感病甚至絕收（圖1）。選取5號、YNAU335和CLN2037E自交系統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)：YNAU335的TSWV發(fā)病率和病情指數(shù)都為0；5號和CLN2037E自交系發(fā)病率均為100%，病情指數(shù)分別為53.3和46.3。

圖1　田間番茄對TSWV的抗性鑒定

2.2人工接種TSWV的番茄抗性鑒定

人工接種TSWV后，除了自交系YNAU335，其他品種（系）都表現(xiàn)感染TSWV的典型癥狀，而且植株生長被嚴重抑制（圖2）。自交系YNAU335的TSWV發(fā)病率和病情指數(shù)均為0，表現(xiàn)為免疫；而5號和CLN2037E自交系的發(fā)病率分別為65%、60%，病情指數(shù)分別為36.7、29.2，表現(xiàn)為感病。

2.3RT-PCR鑒定番茄對TSWV的抗性及TSWV株系的確定

分別選取大田和人工接種的5號、C LN2037E和YNAU335自交系的葉片，RT_PCR克隆TSWV核衣殼蛋白基因和小片段RNA 3′端序列，結(jié)果在5號與CLN2037E葉片中均克隆出這2個核酸片段，而在YNAU335中卻未克隆出（圖3）。進一步測序發(fā)現(xiàn)，5號和CLN2037E自交系中核衣殼蛋白基因和小片段RNA 3′端序列完全相同，大小分別為781 bp和865 bp。選取核衣殼蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4），發(fā)現(xiàn)TSWV分離物YNAU2015與來自昆明（AEK28762）（尹躍艷等，2013）和意大利（ADB96076）的分離物的核衣殼蛋白序列完全相同，而與另一個來自昆明的TSWV分離物（HM594685）核衣殼蛋白（唐前君等，2010）的同源率為98.84%，有3個氨基酸殘基突變。

圖2　番茄TSWV的人工接種抗性鑒定

圖3　番茄葉片TSWV核衣殼蛋白基因和小片段RNA 3′ 端序列凝膠電泳結(jié)果

圖4　TSWV核衣殼蛋白序列的系統(tǒng)進化樹

3　結(jié)論與討論

番茄品種拉比作為YNAU335的親本，引自以色列，由先正達公司選育，于2006～2009年在云南番茄主產(chǎn)區(qū)元謀縣國家科技綜合示范園試種推廣，拉比除了具有穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)良性狀外，其他病毒病發(fā)病率為0（趙俊等，2011）。本課題組以拉比為親本，經(jīng)過連續(xù)7代自交，選育出純合自交系YNAU335。課題組2012年偶然發(fā)現(xiàn)YNAU335可能對TSWV 有抗性，2013～2015年連續(xù)3 a對YNAU335進行系統(tǒng)的抗性鑒別，以確定其對TSWV的抗性。

目前TSWV抗病資源主要集中在秘魯番茄和智利番茄等野生番茄中，抗性遺傳規(guī)律分別由顯性質(zhì)量基因Sw-5和Sw-7控制，而且2個基因并不連鎖，打破Sw-5抗性的TSWV突變生理小種并不能打破Sw-7基因（Boiteux &giordano，1993；Canady et al.，2001；Hoffmann et al.，2001）。本課題組使用與Sw-5連鎖的共顯性SCAR標記（Dianese et al.，2010），對自交系YNAU335進行分析，結(jié)果并未克隆出任何條帶（文章未列出），說明YNAU335對TSWV的抗性并不是由Sw-5基因控制。由于目前沒有發(fā)掘出與Sw-7基因連鎖的分子標記，課題組還不能確定YNAU335對TSWV的抗性是否是由Sw-7控制，后期還需繼續(xù)研究YNAU335的抗性遺傳機理。

隨著Sw-5基因的發(fā)現(xiàn)，國外選育了一系列抗TSWV番茄品種（Stevens et al.，1991；Spassova et al.，2001）。TSWV生理小種存在地理差異性，而抗病品種中的抗病基因具有小種特性抗性，國外選育的抗病品種并不一定適合中國。最近幾年，TSWV對國內(nèi)番茄的危害日益嚴重，因此，選育適合我國的抗病品種顯得尤為重要。YNAU335對TSWV表現(xiàn)為免疫，而且農(nóng)藝性狀良好，植株生長健壯，為無限生長型，果實紅色，最大單果質(zhì)量可達335g，可用于今后番茄抗TSWV育種中。

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Resistance Identifi cation of Tomato Inbred Line ‘YNAU335’ to TSWV

MO Yun_rong1，ZHANG Pei_xin1，DENGming_hua1，YANG Zheng_an1，ZHU Hai_shan1，ZHANG Hong1，TANG Xiao_qian1，WEN Ling2，MA Zhong_fei3，ZHAO Kai1*
（1College of Landscape and Horticulture，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，Yunnan，China；2Dong_ chuandistrict Cash Crops Technology Extension Station，Dongchuan 654100，Yunnan，China；3Horticultural Technology Extension Station of Zhaoyangdistrict，Zhaotong 657000， Yunnan，China）

ReCently，Tomato spotted wilt virus（TSWV）has beCome a seriousdisease hazarding tomato produCtion. IdentifiCation and seleCtive breeding ofdisease_resistant varieties is an effeCtive approaCh to Control TSWV. This experiment seleCted tomato varieties（lines）bred by ourgroup and introduCed from other Countries，through virus transmission by thrips ingreenhouse，and artifiCial inoCulation in illumination inCubator for 3 ConseCutive years to identify thedisease resistanCe against TSWV. The results indiCated that inbred line ‘YNAU335’ was immune to TSWV，while the other varieties were all susCeptible to TSWV. Furthermore，the nuClear proteingene and small RNA 3′flank sequenCes of TSWV in leaves of ‘YNAU335’ were not Cloned. On the Contrary，these 2 sequenCes were Cloned in other tomato leaves. The results preliminarilydemonstrated that ‘YNAU335’ was resistant to TSWV，and Could be used asdisease resistant tomato resourCe in resistant breeding against TSWV .

Tomato；Tomato spotted wilt virus；Disease resistant breeding；NuCleoCapsid proteingene；ResistanCe identifiCation

莫云容，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬持逆境抗性育種，E_mail：moyunrong0408@aliyun.Com

（Corresponding author）：趙凱，博士，講師，專業(yè)方向：蔬持逆境抗性育種，E_mail： kailixian1023@aliyun.Com

2015_12_09；接受日期：2016_03_04

國家自然科學(xué)基金項目（31460525，31260481），云南省 科技計劃面上項目（2015F B144），云南省教育廳項目（2015Y187）