阿爾茨海默病線粒體鐵蛋白的表達情況研究

湖南中醫藥高等專科學校（412012）劉起勝

湖南中醫藥大學（410007）成紹武 廖君 黃娟 葛金文

目前，已有研究顯示線粒體鐵蛋白（MtFt）與眾多神經變性疾病有密切關系[1]，如不凝腿綜合征、帕金森癥以及遺傳性家族共濟失調等。本研究特進行相關大鼠實驗后報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 60只雄性大鼠由湖南醫科大學動物實驗中心提供，重量200～220g，許可證號SCXK（湘）2008-2002。

1.2 模型制備 模型組大鼠注射0.35g/kg劑量10%水合氯醛麻醉，后固定于I-C型腦立體定位儀上，常規消毒后切開皮膚，充分暴露前囟，參考大鼠腦立體定位圖譜確定海馬CA2區具體位置，后沿著垂直方向兩側埋植套管針，深度約24mm。1周后微量注射針對模型組大鼠兩側各推注Aβ寡聚體5ul，1次/d，連續3d。所有大鼠均為清潔級飼養。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 切取大鼠海馬CA2區，①樣本于PBST液中清洗3遍，清洗時間5min/次。②將0.5%雙氧水、PBST液混合，后置入樣本浸泡約30min；取出樣本重復①。③將PBST液、MtFt單克隆抗體混合，將后者稀釋10倍；置入樣本于4℃孵育16h。樣本取出重復①。④用PBST液將生物素化后的IgG抗體稀釋1000倍，后置入樣本室溫孵育1h，取出切片樣本重復①。⑤應用PBST液將ABC試劑3000倍稀釋，后置入樣本常溫孵育1h，取出切片樣本重復①。⑥取500ul0.01g/ml的DAB液、3.75ul30%的雙氧水、1ml7%的鎳離子液以及25mlTris-HCl液制成混合液，后置入樣本，待其變色后加入Tris-HCl溶液以終止反應。⑦取出樣本置于載玻片后置干燥板上干燥。⑧將干燥好的樣本用乙醇液脫水，后將樣本放入二甲苯內浸泡5min，后蓋上蓋玻片。

1.3.2 real-time PCR 首先分別提取樣本中RNA，制備cRNA。real-time PCR反應流程為：25℃10min，48℃30min，95℃5min，25℃10min。整個反應連續進行25個循環。

1.4 數據處理 SPSS18.0軟件進行統計，計量資料“±s”表示，用t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣本染色結果 經切片觀察顯示，AD大鼠海馬CA2區MtFt數量及密度均顯著高于正常大鼠。

2.2 real-time PCR法檢測情況（見附圖）。IMR-32分別加入轉染試劑、轉染空質粒、MtFt質粒，轉染有MtFt的IMR-32細胞中mRNA表達量顯著降低，P＜0.01差異顯著。

附圖 real-time PCR法檢測情況

3 討論

鐵作為生命體不可或缺的一種金屬元素，具有維持細胞正常功能的作用，參與了腦組織中重要代謝過程。線粒體是細胞電子傳遞以及能量代謝最為旺盛的細胞器，而細胞所攝取的大部分鐵都需進入到線粒體內參與相關代謝過程。

相關研究顯示，MtFt的結構、功能與胞漿中鐵蛋白有高度同源性，且其可能具有調節線粒體穩態，保護線粒體免受應激損傷，對血紅素、鐵硫基團合成等方面的調節作用。本研究通過建立AD大鼠模型發現，MtFt在腦組織神經元內廣泛存在，但通過對AD模型大鼠海馬CA2區我們發現，模型組MtFt數量及密度均顯著高于對照組大鼠。說明MtFt在AD所致的病理狀態變化下表達量明顯增加。同時，本研究還顯示轉染有MtFt的IMR-32細胞中mRNA表達量顯著降低。說明MtFt能夠改善Aβ所致的炎癥反應，對細胞具有一定保護作用。這提示MtFt對AD病變時炎性反應損傷有保護作用，有助于抵抗細胞早期凋亡。

綜上，AD病變發生后MtFt表達量顯著升高，而MtFt對AD所致炎癥反應具有一定保護作用。