新型納米乳佐劑在口蹄疫疫苗中的應用研究

陳苗苗 董金杰 杜平

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新型納米乳佐劑在口蹄疫疫苗中的應用研究

陳苗苗 董金杰 杜平

（中農威特生物科技股份有限公司 甘肅 蘭州 730046）

本研究創制新型納米佐劑與口蹄疫O型滅活抗原按1:1比例配制疫苗，并對該疫苗的物理性狀、安全性以及免疫效果進行系統研究，結果表明，新型納米佐劑疫苗流動性佳，易注射，穩定性好，免疫副反應小以及免疫效果均優于商品化ISA206佐劑疫苗，為納米乳疫苗的后期研究與應用提供依據。

口蹄疫滅活疫苗 新型納米佐劑 免疫效果

口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和快速遠距離傳播的疫病，其特征為患病動物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位發生水皰，破潰后形成爛斑。主要通過消化道、呼吸道、破損的皮膚、粘膜、眼結膜、人工授精來進行直接或間接性傳播[1-2]。目前對患病牲畜尚無有效的治療方法，只有使用口蹄疫疫苗接種動物進行積極預防。常規滅活疫苗仍然是當前FMD免疫控制采用的主要疫苗，又以法國SEPPIC公司的ISA206雙相油佐劑疫苗為市場主導疫苗，但其成本偏高，刺激機體產生的細胞免疫較弱并伴有接種反應限制了它的應用。

納米乳是由油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑按適當比例形成的一種透明、低黏度且熱力學穩定的分散體系[3]。近年來研究表明,納米乳具有穩定性好、安全性高、生物利用度高等優點,是一種極具潛力的新藥物載體。本研究采用先進的納米技術創制新型納米佐劑，將口蹄疫抗原包裹于納米乳中,制備成雙相口蹄疫納米乳疫苗(Foot-and-mouth disease virus nanoemulsion, FMD-NE)，以通過納米載體的穩定、安全、靶向[4]、緩釋[5]等優點來克服普通疫苗的缺點,研發出有效預防口蹄疫的新型疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原 豬口蹄疫O型滅活抗原(批號20151101，本公司生產部提供)。

1.1.2 佐劑 新型雙相納米佐劑(本公司研發部創制)。

1.1.3 對照疫苗 豬口蹄疫O型滅活抗原(批號20151101，本公司生產部提供)與法國SEPPIC公司的ISA206佐劑按1:1質量比乳化配制。

1.1.4 試驗動物 40kg左右健康易感豬，乳鼠中和抗體滴度≤1:4或口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體滴度≤1:8,3ABC液相阻斷ELISA抗體陰性。

1.1.5 儀器設備與試劑 JEM-1230透射電鏡(日本JE-OL公司)、酶標儀(購自博樂公司)、LS13320 ULM型激光粒度分析儀(美國BECKMAN COULTER公司)、口蹄疫血清抗體檢測ELISA試劑盒(購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所)。

1.2 方法

1.2.1 空白納米乳的配方篩選 利用偽三元相圖法篩選納米乳配方[6]。分別用Tween 80、Span 80、聚氧乙烯雙油酸酯按不同質量配比來選取表面活性劑,從乙醇、1,2-丙二醇、1,3-丁二醇中選取助表面活性劑,從麥芽油、液體石蠟、花生油中選取油相,使表面活性劑/助表面活性劑(Km=5:1、5:2、5:4)與油相分別按照9.9:0.1、9:1、8:2、7.5:2.5、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9的質量比變化。準確稱取各組分后，置燒杯中，室溫下攪拌，同時逐滴滴加PBS緩沖液，記錄體系狀態變化的臨界點(由清至濁或由濁至清)，記錄此時PBS的質量。應用Origin Pro 7.5軟件，繪制偽三元相圖，確定納米乳區。根據相圖中納米乳區的大小，確定其組分及比例，篩選出最佳配方。

1.2.2 口蹄疫納米乳的制備 O型口蹄疫滅活抗原作為水相，按操作規程制備O型口蹄疫納米乳疫苗。

1.2.3 O型口蹄疫納米乳疫苗的性狀鑒定 （1）O型口蹄疫納米乳的劑型鑒別[7-8]：分別采取顯微鏡和染色法鑒定所制備的乳液是否是雙相W/O/W納米乳。（2）O型口蹄疫納米乳微觀形態及粒徑分布[9]：取O型口蹄疫納米乳10ml，用無水乙醇稀釋200倍后磷鎢酸負染，透射電鏡下觀察其微觀形態;采用激光粒度分析儀測定其平均粒徑、多分散系數(Polydispersity index，PDI)及強度粒徑分布[9]。（3）黏度測定：用1ml吸管在室溫下吸取1ml乳劑，記錄垂直滴出0.4ml所需的時間(s)。（4）離心穩定性檢測：吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心30min，觀察是否有分層現象。（5）放置穩定性試驗[10]：將3批O型口蹄疫納米乳密封于5ml西林瓶中，分別在4℃、20℃、37℃的條件下放置6個月，分別于試驗開始時及1、3、6月末取樣，對其外觀進行觀察。（6）安全性檢驗：用體重350~450g的豚鼠5只，皮下注射2ml/只；用體重18~22g的小白鼠5只，皮下注射疫苗0.5ml/只。連續觀察7d。觀察是否有因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應或全身不良反應。用30~40日齡的健康易感豬(經乳鼠中和試驗測定無口蹄疫中和抗體)2頭，各兩側耳根后分點肌肉注射2頭份疫苗，逐日觀察14d。觀察是否有因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應或全身不良反應。（7）抗體效價檢測：用體重40Kg左右的健康易感架子豬(經乳鼠中和試驗測定無口蹄疫中和抗體)22頭，隨機分成3組，A組10頭份，分別于耳根后肌肉注射2ml納米疫苗，B組10頭份，分別耳根后肌肉注射2ml206佐劑疫苗，2頭份作為空白對照，分別在免疫后6周每隔7d采集靜脈血，其血清進行液相阻斷ELISA試驗，判定抗體水平。

2 結果

2.1 FMD-NE最佳配方篩選

以聚氧乙烯雙油酸酯和Tween 80為表面活性劑，聚乙二醇為助表面活性劑，液體石蠟為油相，所制備的納米乳區最大，性質穩定。當表面活性劑與油相的質量比為2:8、表面活性劑與助表面活性劑Km為9:1時制備的納米乳抗原含量高，體系最穩定。因此，FMD-NE最佳配方為：油相80%，親水性表面活性劑12%，親油性表面活性劑6%，助表面活性劑2%。

2.2 FMD-NE質量評價

（1）FMD-NE結構類型的鑒別：FMD-NE通過顯微鏡觀察，可見納米乳液滴雙圓環微粒(見圖1)，表明該劑型為雙相體系，染色法顯示蘇丹紅Ⅲ(紅色)擴散速度大于亞甲基蘭(藍色)，表明該體系為W/O/W型。（2）FMD-NE微觀形態觀察及其粒徑分布，透射電鏡觀察可見，納米乳液滴呈球形，大小均勻，分散性良好(圖2)；粒度分析結果表明，納米乳平均粒徑為73nm，粒徑范圍在40nm~ 150nm之間，基本呈正態分布(見圖3)。（3）納米乳的粘度測定：0.4ml納米乳疫苗流出時間為2.4s，在疫苗黏度允許的2-8s范圍之內。（4）FMD-NE穩定性試驗：FMD-NE在37℃放置1個月，4℃、20℃放置6個月，均保持澄清透明液體狀，無絮狀、分層、破乳等現象，表明其穩定性良好。（5）FMD-NE的安全性評價：FMD-NE組及對照組免疫接種后，觀察14 d均未出現疫苗引起的任何局部和全身不良反應，且全部健活。（6）FMD-NE免疫效力試驗：免疫40kg左右試驗豬后每隔7d采集6周的靜脈血，其血清的IgG抗體見表1，由表1可知，A組、B組隨著免疫天數的增加，平均抗體水平明顯上升，與C組對照組有顯著性差異，且A、B組上升幅度不同，A組抗體水平4周開始維持在較高水平，沒有明顯下降趨勢，而B組抗體水平四周達到最高，從第五周開始降低。說明納米疫苗組(A組)比206佐劑疫苗組(B組)免疫試驗豬后，免疫應答好，且在緩釋方面優于206佐劑疫苗，凸顯納米佐劑的優勢。

圖1 FMD-NE顯微鏡10×100乳滴分布

圖2 FMD-NE透射電鏡圖

圖3 FMD-NA的強度粒徑分布圖

表1 免疫小鼠后不同時間各組的IgG抗體效價結果

免疫后時間(周)

3 討論

（1）新型納米佐劑是一采用納米技術進行處理后的雙相油乳劑型佐劑，體系HLB值是由乳化劑和助乳化劑的種類及數量決定，只要各組分比例恰當，混合均勻后可自發形成納米乳[11]。因此，納米乳配方的篩選就是選擇合適組分和恰當的比例。本研究采用偽三元相圖法，篩選出最佳配方并制備出水包油包水的雙相FMD-NE。采用該佐劑配制的口蹄疫滅活疫苗與商品化的油苗比較，不僅配苗簡單，而且也顯示了優良的穩定性[12]。（2）免疫效力試驗表明，FMD-NE組產生的抗體滴度比206佐劑疫苗組高，且維持時間延長，以上數據表明，納米佐劑載體具有佐劑效應，提高抗體的免疫原性，且具有較好的緩釋效果，使抗體維持在較高水平，免疫效果良好。

本研究制備的FMD-NE穩定性良好，接種安全，誘導機體產生較高的抗體水平，因此該納米乳疫苗具有常規疫苗不可比擬的優勢[13]。

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（2016–06–13）

S859.79

A

1007-1733(2016)09-0005-03

國家高新技術研究發展計劃(“863”計劃 2011AA10A211)