長鏈非編碼RNA SUMO 1P3對人肝癌HepG2細胞惡性生物學行為的影響

甘園園　何曉琴　徐細明武漢大學人民醫：腫瘤科，湖北武漢430060

長鏈非編碼RNA SUMO 1P3對人肝癌HepG2細胞惡性生物學行為的影響

甘園園何曉琴徐細明▲
武漢大學人民醫：腫瘤科，湖北武漢430060

目的探討長鏈非編碼RNA SUMO1P3對人肝癌HepG2細胞惡性生物學行為的影響。方法收集40例來自武漢大學人民醫：肝癌患者手術后肝癌及其癌旁組織標本，人肝癌細胞系和正常肝細胞由武漢大學人民醫：中心實驗室保存。采用實時熒光定量PCR技術（RT-PCR）檢測SUMO1P3在肝癌及癌旁組織、肝癌細胞及正常肝細胞中表達情況。實驗分為si-NC組和si-SUMO1P3組，應用小干擾RNA（siRNA）轉染HepG2細胞，分別以CCK8法、流式細胞術、劃痕實驗及Transwell侵襲實驗檢測下調SUMO1P3對HepG2細胞增殖、凋亡及侵襲轉移的影響。結果SUMO1P3在肝癌組織中較對應的癌旁組織顯著高表達（P＜0.05）；SUMO1P3在肝癌細胞株中較正常肝細胞顯著高表達（P＜0.05）。肝癌細胞轉染48 h后si-SUMO1P3組較si-NC組SUMO1P3表達明顯下調（P＜0.05）；CCK8實驗顯示，si-SUMO1P3組轉染24、48、72、96 h后吸光度值均低于si-NC組（P＜0.05）；流式細胞術顯示，si-SUMO1P3組細胞凋亡率高于si-NC組（P＜0.05）；劃痕實驗證明，si-SUMO1P3組細胞遷移抑制率高于si-NC組（P＜0.05）；Transwell實驗表明，si-SUMO1P3組穿膜細胞數明顯少于si-NC組（P＜0.05）。結論LncRNA SUMO1P3可能與肝癌細胞的增殖、凋亡及侵襲轉移等生物學行為密切相關。

肝癌；長鏈非編RNA；SUMO 1P3；生物學行為

［Avsteact］Ov jective To explore the effects of LncRNA SUMO1P3 on malignant biological behaviors of hepatocellular carcinoma HepG2 cells.M ethods A total of 40 liver cancer tissues and their paracarcinoma tissueswere obtained from patientswho underwent radical resections in Renmin Hospital ofWuhan University.The liver cancer cells and normal cellwere preserved in Central Laboratory，Renmin Hospital ofWuhan University.RT-PCR technology was used to confirm the expression level of SUMO1P3 in tissues and cells.The experiment divided into si-NC group and si-SUMO1P3 group.After transfected siRNA into the HepG2 cells，cell counting kit 8，flow cytometry，wound healing and transwell chamberswere used to examine the proliferation，apoptosis，metastasis and the invasion ability.Results Compared with paracarcinoma tissues and normal liver cells，SUMO1P3 was significantly highly expressed in liver cancer tissues and cells（P＜0.05）.After transfected 48 h，compared with si-NC group，SUMO1P3 was down-regulated expression in si-SUMO1P3 group（P＜0.05）.CCK8 assay demonstrated that the absorbance values of si-SUMO1P3 group were lower than those of si-NC group after transfection 24，48，72，96 h（P＜0.05）.Flow cytometry showed that the apoptosis rate of si-SUMO1P3 group was significantly higher than that of si-NC group（P＜0.05）.Wound healing proved that the metastasis inhibiting rate of si-SUMO1P3 group wasmuch higher than the si-NC group（P＜0.05）.Transwell assay revealed that the number of cells through thewell in si-SUMO1P3 group were less than that in si-NC group（P＜0.05）. Conclusion LncRNA SUMO1P3may play an important role in proliferation，apoptosis，metastasis and invasion of hepatocellular carcinoma cells，and can serve as an effective target for cancer gene therapy.

［Key woeds］Hepatocellular carcinoma；Long non-coding RNA；SUMO1P3；Biology behaviors

原發性肝癌是常見的消化道腫瘤，發病率和死亡率高，目前亟需尋找早期診斷和有效治療肝癌的新方法［1］。長鏈非編RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一種轉錄本大于200個核苷酸的RNA，可以通過表觀遺傳、轉錄及轉錄后調控等方式參與疾病的發生［2］。研究證實，某些lncRNA在腫瘤的表達水平會發生特異性改變，可以作為診斷癌癥的標志物和潛在的藥物作用靶點［3-4］。已有文獻報道lncRNA SUMO1P3在胃癌、膀胱癌中顯著高表達，且能夠影響腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲轉移［5-6］。本研究檢測肝癌組織和肝癌細胞中SUMO1P3表達水平，使用小干擾RNA技術下調肝癌細胞株HepG2中SUMO1P3的表達，驗證其對肝癌細胞生物學行為的影響，為肝癌診斷和治療提供依據。

1　材料與方法

1.1組織、細胞和主要試劑

肝癌及其癌旁組織標本來自武漢大學人民醫：手術肝癌患者。人肝癌細胞和正常肝細胞由武漢大學人民醫：中心實驗室保存。SUMO1P3引物為5＇-GAACTGGGAATGGAGGAAGA-3＇和5＇-TGAGAAAGGATTGAGGGAAA-3＇，購自武漢巴菲爾生物公司。SUMO1P3小干擾RNA（siRNA）購自廣州市銳博生物公司，序列：5＇-TGGCCCTGATGTTCTAGCATGTGAT-3＇。

1.2細胞培養、轉染及分組

HepG2細胞加入5 mL RPMI 1640培養液，放于5%CO2、37℃恒溫細胞培養箱中進行培養。選取生長狀態良好的細胞，以5×105個/孔的密度接種于6孔板，待細胞生長到60%～80%融合時使用無血清培養液進行轉染。轉染后6 h換成含10%胎牛血清的培養液繼續培養。分為si-NC組和si-SUMO1P3組。

1.3CCK8法繪制細胞生長曲線

將各組HepG2細胞分別以4×103個/孔接種于96孔板，轉染后0、24、48、72、96 h每組取6孔，加入CCK8 10μL/100μL，37℃培養2 h后用全波段酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度（A）值。

1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡

在轉染后48 h的HepG2中加入500μL緩沖液，5μL Annexin V-FITC和10μL的PI混勻，使用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.5劃痕實驗

用10μL白色槍頭在轉染后的6孔板細胞底面進行劃痕，加入無血清1640培養基繼續培養，在0 h和24 h照相，測各組劃痕寬度，取平均值計算遷移抑制率。

1.6Transwell侵襲實驗

Transwell上室鋪用Matrigel基質膠600μL，將200μL轉染后的細胞懸液（5×104/L）加入上室，下室加600μL低血清的培養液培養24 h。結晶紫染色30min后在顯微鏡下拍照，最終以穿膜細胞的數目代表HepG2細胞的侵襲能力。

1.7統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1LncRNASUMO 1P3在肝癌組織和肝癌細胞株中表達情況

采用RT-PCR技術檢測40例肝癌與癌旁標本SUMO1P3表達水平，發現40對標本中有29對（72.5%，29/40）標本中肝癌比癌旁組織SUMO1P3高表達，肝癌和癌旁組織SUMO1P3表達差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。培養人肝癌細胞系和正常肝細胞，使用RT-PCR技術檢測SUMO1P3表達水平，發現其在肝癌細胞系中顯著高表達（圖2），其中在HepG2細胞中表達最高，故后續實驗選擇使用HepG2細胞。

圖1　40例肝癌及癌旁組織SUMO1P3表達情況

圖2　肝癌細胞系和正常肝細胞SUMO1P3表達情況

2.2 siRNA對肝癌細胞內SUMO 1P3表達的影響

在肝癌細胞株HepG2中進行siRNA轉染，si-SUMO1P3組細胞內SUMO1P3表達降低，為si-NC組的（24.33±3.15）%，兩組差異有統計學意義（t=25.01，P＜0.05），見圖3。表明轉染SUMO1P3 siRNA可下調HepG2細胞內SUMO1P3的表達。

圖3　RT-PCR檢測siRNA干擾后細胞SUMO1P3表達

2.3下調SUMO1P3對細胞增殖的影響

轉染siRNA SUMO1P3后，HepG2細胞的生長明顯受到抑制，見圖4。轉染24、48、72、96 h后，si-NC組吸光度值分別為（0.5117±0.0035）、（1.0336±0.0097）、（1.3263±0.0081）、（1.6853±0.0073）；si-SUMO1P3組吸光度值分別為（0.4533±0.0041）、（0.8446±0.0065）、（1.0512±0.0096）、（1.2363±0.0102）；兩組吸光度值比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.4下調SUMO1P3對細胞凋亡的影響

轉染48 h后，流式細胞術測得si-NC組細胞凋亡率為（13.59±1.36）%，si-SUMO1P3組細胞凋亡率為（38.28±3.41）%，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

2.5下調SUMO1P3對細胞遷移的影響

轉染48 h，si-NC組細胞劃痕遷移率為（13.69± 0.15）%，si-SUMO1P3組細胞劃痕遷移率為（36.92±0.43）%，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6。

圖4　SUMO1P3對肝癌細胞增殖的影響

圖5　SUMO1P3對肝癌細胞凋亡的影響

圖6　SUMO1P3對肝癌細胞遷移的影響

2.6下調SUMO 1P3對細胞侵襲的影響

轉染48 h后，si-NC組細胞穿膜個數為（119.00± 8.53）個，si-SUMO1P3組細胞穿膜個數為（54.00± 7.12）個，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖7。

圖7　SUMO1P3對肝癌細胞侵襲的影響

3　討論

原發性肝癌是人類常見的惡性腫瘤，其目前的治療手段有手術切除、放化療、靶向治療及生物治療等［7］，但由于肝癌發現時大多已屬于晚期，治療效果不理想，總體5年生存率較低［8］。LncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，不具有生物學功能［9］。然而，大量研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾［10］、轉錄激活、轉錄干擾等多種重要的調控過程［11］。已有一些lncRNA被證明可作為肝癌的標志物或預后因子［12］，如肝癌高表達基因（HULC）［13］、同源異形盒基因（HOX）轉錄反義RNA（HOTAIR）［14］、肺腺癌轉移相關轉錄子1（MALATl）［15］、母系表達基因3（MEG3）［16］、H19等［17］。LncRNA種類繁多，作用方式多樣化，近期研究發現LincRNA UFC1能夠通過結合穩定HuR mRNA從而活化β-Catenin，抑制肝癌細胞增殖［18］。LncRNA-ATB在被TGF-β活化后可以促進EMT發生，進而促進肝癌細胞侵襲轉移［19］。而LncRNA-HOTAIR通過下調SETD2能夠促進肝癌腫瘤干細胞增殖，導致化療耐藥的發生［20］。即使如此，當前關于LncRNA在原發性肝癌中的認知仍然非常有限。

SUMO1P3是小泛素樣修飾蛋白1假基因3（small ubiquitin-likemodifier 1 pseudogene 3）。已被證實SUMO1P3在胃癌組織中較對應的癌旁組織顯著高表達，其表達水平與腫瘤大小、組織分化、淋巴結轉移和侵襲等臨床病理特征相關，表明SUMO1P3有可能是胃癌診斷的標志物之一［5］。Zhan等［6］研究證實，SUMO1P3在膀胱癌組織顯著高表達，表達水平與組織分級和TNM分期相關，在膀胱癌細胞中下調SUMO1P3能夠抑制癌細胞增殖和侵襲，促進癌細胞凋亡。目前尚無關于SUMO1P3在肝癌中的研究。本研究利用RNA干擾技術干擾肝癌HepG2細胞中SUMO1P3的表達，可見下調SUMO1P3能顯著抑制HepG2細胞的增殖和侵襲轉移，并促進細胞凋亡，提示內源性SUMO1P3在肝癌細胞惡性生物學行為中起著關鍵作用，SUMO1P3可能成為肝癌診斷和預后的監測指標及治療靶點。

綜上所述，SUMO1P3與肝癌的發生、發展及轉移密切相關，干擾SUMO1P3的表達可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲轉移，并促進細胞凋亡，相關的調控機制還有待進一步研究證實。

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Effects of long non-coding RNA SUMO1P3 on malignant viological vehavioes of hepatocellulae caecinoma HepG2 cells

GAN Yuanyuan HE Xiaoqin XU Ximing

Department of Oncology，Renmin Hospital ofWuhan University，Hubei Province，Wuhan 430060，China

R735.7

A

1674-4721（2016）08（c）-0031-05▲

2016-04-22本文編輯：程銘）

湖北省自然科學基金（2012FKC14301）。

甘園園（1989.12-），女，武漢大學人民醫：2014級腫瘤學專業在讀碩士研究生；研究方向：肝癌發病機制。