維藥毛菊苣水提取物抗炎作用的實驗研究

楊巧麗　王　雪　馬雪萍　劉　燕　司麗君　史玉柱新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆烏魯木齊830004

維藥毛菊苣水提取物抗炎作用的實驗研究

楊巧麗王雪馬雪萍劉燕司麗君史玉柱
新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆烏魯木齊830004

目的探討維吾爾族習用藥材毛菊苣水提取物（MS）的抗炎作用。方法體外采用脂多糖（LPS）誘導小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞，建立炎癥模型。采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測MS的細胞毒性作用，采用Griss法檢測細胞上清中NO的生成量，酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測細胞上清中白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-10（IL-10）的水平；在體實驗采用冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進模型，觀察MS的體內抗炎作用。結果體外實驗，與空白對照組比較，MS 250μg/mL以下濃度對RAW264.7細胞生長無影響。MS 15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL濃度均可明顯抑制LPS誘導的RAW264.7細胞上清中NO和IL-10的生成（P＜0.01），此外，250μg/mL劑量組可顯著抑制IL-1β的分泌（P＜0.01），且隨著MS濃度的升高，對TNF-α分泌的抑制作用逐漸增強；在體實驗，與模型組比較，MS 130、260mg/kg劑量組對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進均有顯著的抑制作用（P＜0.01），抑制率分別達到49%和57%。結論MS具有顯著的抗炎活性。

毛菊苣；水提取物；抗炎作用；RAW 264.7細胞；白細胞介素-1β：白細胞介素-10；腫瘤壞死因子-α

［Avsteact］Ov jective To investigate the anti-inflammatory effects of CichoTium glandulosum Boiss.et Huet aqueous extracts（MS）.M ethods In vitTo，lipopolysaccharide was used to induce RAW264.7 cells to build model of inflammation. The effect of MSon cell toxic was detected bymethyl thiazolyl tetrazolium assay（MTT）.The NO generation in cell supernatantwas detected by Grissmethod，and the levels of interleukin-1β（IL-1β），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin 10（IL-10）in cell supernatantwere detected by Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.In vivo，themodels of the increase of capillary permeability in mice induced by acetic acid were used to evaluate the anti-inflammatory effect of MS.Results In vitTo，compared with the control group，MS（≤250μg/mL）had no influence on the proliferation of RAW264.7 cells.MS 15.625，31.25，62.5，125，250μg/mL significantly decreased the levels of NO and IL-10（P＜0.01）.Meanwhile，250μg/mLMSsignificantly decreased the levels of IL-1β（P＜0.01），and with the increase of the concentration of MS，the inhibition on TNF-αsecretion gradually strengthened.In vivo，compared with themodel group，130，260 mg/kg MS significantly inhibited the increase of abdominal cavity capillary permeability in mice caused by acetic acid（P＜0.01），the inhibition rate was 49%and 57%respectively.Conclusion MShas significantanti-inflammatory effects.

［Key woeds］CichoTium glandulosum Boiss.et Huet；Aqueous extracts；Anti-inflammatory effect；RAW264.7 cells；Interleukin-1β；Interleukin-10；Tumor necrosis factor-α

維吾爾族習用藥材菊苣（CichoTii HeTba/CichoTii Radix）為菊科植物毛菊苣（CichoTium glandulosum Boiss.et Huet）或菊苣（CichoTium intybus L.）的干燥地上部分或根，2015年版《中國藥典》收載品種［1］，是清熱卡森顆粒（國藥準字Z65020172）、護肝布祖熱顆粒（國藥準字Z65020168）、復方木尼孜其顆粒（國藥準字Z65020166）、炎消迪娜兒糖漿（國藥準字Z65020183）的主要原料藥材［2-3］。維吾爾醫習用毛菊苣水提取物（MS）治療肝炎、膽囊炎等炎癥性疾病，以上4個方劑的現代藥理學研究也已證實該方面的功效［4-8］。臨床研究表明，肝臟炎癥壞死及其所致的肝纖維化［9］是肝炎疾病進展的主要病理學基礎。因此，在對病因治療的基礎上有效控制肝組織炎癥，有可能減少肝細胞破壞和延緩肝纖維化的發展［10-11］。故本課題在研究MS保肝和體外抗乙型肝炎作用的同時，擬開展其抗炎作用的研究，查閱相關文獻抗炎作用的研究尚屬空白，故本研究采用MS處理巨噬細胞系RAW264.7細胞，建立炎癥模型，并結合其對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進模型的研究，旨在初步探討MS的抗炎作用，為毛菊苣的臨床開發應用提供理論線索。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

毛菊苣全草，采自新疆吉木薩爾縣泉子街鎮十八戶村，藥材經新疆藥物研究所維藥室何江副研究員鑒定，MS樣品為新疆藥物研究所制備，岀膏率為10.7%；地塞米松（Dexamethasone，DEX，浙江仙琚制藥股份有限公司生產，批號：140672）；脂多糖（LPS）（sigma公司，批號：L2880）；冰醋酸（天津市福晨化學試劑廠，批號：20130112）；伊文思藍（上海化學試劑采購供應站分裝廠出品，批號：20120917）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-10酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司，批號：20140722）。

1.2動物和細胞株

SPF級6～8周齡，昆明種小鼠，雌雄兼用，體重18～22 g；由新疆實驗動物研究中心提供，生產許可證號：SCXK（新）2011-0001。動物適應性喂養3 d，適應期12 h/12 h明暗交替，并觀察動物毛發、排泄物、活動及體重生長情況，動物正常采食、飲食，并最終選取合格動物進入實驗。小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7（中國醫學科學：協和藥物研究所篩選中心惠贈）。

1.3儀器

Spectramax M2型微孔板監測系統，Molecular Devices；SP-752型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；SW-CT-2FD型蘇凈安泰超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；XDS-1B倒置顯微鏡，重慶光學儀器廠。

1.4方法

1.4.1MS對LPS誘導RAW264.7細胞NO的生成和TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表達量的影響

1.4.1.1RAW264.7細胞培養的培養與傳代小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基，置于含5%CO2、37℃培養箱中培養。細胞生長至70%～80%融合后進行傳代，3～4 d左右傳代1次。

1.4.1.2MTT法檢測不同濃度MS對RAW264.7細胞生長的影響取對數生長期的小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞，依據文獻方法［12-15］，測定終濃度7500、3750、1875、937.5、468.75、234.4μg/mL的MS對RAW264.7細胞生長的影響，并計算抑制率。抑制率=（A空白對照組-A給藥組）/A空白對照組×100%。

1.4.1.3MS對細胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10表達的影響［16-18］于96孔細胞培養板中每孔加入100μL（2× 105個細胞/mL）細胞懸液，將培養板置于CO2培養箱中培養12 h，每孔換成無血清的180μL RPMI 1640培養液。先于每孔中加入DEX和5個不同濃度（“1.4.1.2”確定的無毒濃度）的MS培養液10μL置于37℃、5%CO2培養箱中作用1 h，每個濃度設3個平行孔，另設正常對照孔（control組）、模型組（LPS組）。1 h后細胞對照孔和模型組分別加入20μL/孔和10μL/孔無血清的180μL RPMI 1640培養液，其余各組每孔分別加入終濃度1μg/mL的LPS 10μL補足體系200μL/孔，混勻后置于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h，吸取培養上清液，Griss法測定NO濃度，ELISA法測定TNF-α、IL-1β、IL-10的濃度。

1.4.2對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進的影響［19］

將48只昆明種小鼠，依性別、體質量均衡隨機分為模型組、DEX 9.7 mg/kg組和MS 130、260 mg/kg劑量組，共4組，每組12只，灌胃給藥1次/d，連續4 d，末次給藥后1 h，各鼠均尾靜脈注射0.5%伊文思藍生理鹽水溶液0.1 mL/10 g，隨即腹腔注射0.8%冰醋酸0.2mL/只，20min后脫頸椎處死小鼠，剪開腹部皮膚肌肉，用6mL生理鹽水分數次洗滌腹腔，吸出洗滌液，3000 r/min（離心半徑：6 cm）離心5 min，取上清液于590 nm測定吸光度值，并進行組間t檢驗。抑制率（%）=（A590nm模型組-A590nm給藥組）/A590nm模型組×100%。

1.5統計學方法

運用SPSS 13.0統計軟件進行處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1MTT法檢測不同濃度MS對RAW 264.7細胞生長的影響

空白對照組和MS 234.4、468.75、937.5、1875、3750、7500μg/mL劑量組測定的吸光度值見表1。

表1　MS對RAW 264.7細胞生長的影響

2.2MS對細胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10表達的影響

LPS刺激RAW264.7細胞24 h后，與control組比較，LPS組中NO、IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白水平均顯著升高。與LPS組比較，MS（15.625、31.25、62.5、125、250μg/mL）上清中NO的含量和IL-10的分泌量均顯著降低（P＜0.01），TNF-α的蛋白表達量隨MS濃度的增高逐漸降低，此外250μg/mLMS對IL-1β蛋白水平有極顯著的抑制作用（P＜0.01），并且MS細胞上清中NO的分泌量和TNF-α、IL-1β、IL-10的表達量均呈現一定的劑量依賴性。見圖1～3。

圖1　MS對LPS誘導RAW 264.7細胞上清中NO表達的影響（x±s，n=3）

圖2　MS對LPS誘導RAW 264.7細胞上清中IL-1茁堯IL-10表達的影響（x±s，n=3）

圖3　MS對LPS誘導RAW 264.7細胞上清中TNF-琢表達的影響（x±s，n=3）

2.3對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進的影響

各給藥組腹腔洗滌液較模型組為淺，由表2可見，與模型組比較，DEX 9.7mg/kg組，MS 130、260mg/kg劑量組對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進均有顯著的抑制作用（P＜0.01），抑制率分別為51%、49%、57%，表明MS能抑制H+所致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進。

表2　MS對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進的影響（x±s，n=12）

3　討論

炎癥（inflammation）是人類疾病中最常見而復雜的病理過程，可以發生于機體的任何部位和任何組織，是機體清除刺激因素、對局部組織損傷進行修復的過程。大部分患者存在不同程度的炎性反應，會進一步加重疾病的發展，甚至誘發嚴重的腫瘤疾病。故治療與控制患者的炎性反應，對改善疾病的治療效果及預后具有十分重要的意義［20］。

維吾爾醫將MS用于臨床肝炎的治療，現代科學研究表明，肝臟炎癥壞死是導致病毒蔓延與迅速發展的關鍵病理學基礎，在全面找出致病因子的基礎上采取對癥治療才能對肝組織炎癥進行有效的控制，進一步延緩肝纖維化及減少肝細胞損傷的發展［21］。此外在炎性反應過程中的兩類炎癥介質：促炎反應介質（如腫瘤壞死因子、IL-1等）和抗炎反應介質（如IL-10、IL-4、IL-5等），它們以自分泌、旁分泌、內分泌等作用于局部和全身，以正負反饋方式相互調控，炎性反應的轉歸將取決于這兩大類介質的平衡，任何一方的過度優勢均可造成炎癥失控、內環境穩定的破壞。NO在炎癥級聯反應中起到關鍵的調節作用，尤其在炎性反應的發生和信號傳導方面［22］。NO具有促炎性細胞因子如TNF-α、IL-1產生的作用，NO介導和促進炎癥的有力證據是在多種炎癥性或免疫性動物模型中，在NO濃度顯著升高過程中，抑制NO合成可使典型的炎癥癥狀得到明顯改善［23］。探討毛苣菊水提取物的抗炎作用將有助于探明其保肝的作用機制。

在本研究中，在1μg/mL LPS的刺激下，RAW 264.7細胞分泌了炎癥介質和細胞因子：NO、TNF-α、IL-1β、IL-10，而MS抑制了NO的分泌，而NO的減少可能進一步減少了LPS介導的巨噬細胞釋放的炎癥因子類介質TNF-α、IL-1β的分泌量，從而起到抑制炎癥的作用。但IL-10在LPS的刺激下增高后，并未隨著藥物濃度的增高而得以抑制，從而發揮抗炎反應介質的作用，相反它隨著藥物濃度的增高而增高，該疑問期望在今后的實驗研究中尋找到答案。

為進一步考察MS的抗炎活性，本研究選擇了冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進的急性炎癥模型，研究結果表明：MS 130、260 mg/kg劑量組對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進有顯著的抑制作用（P＜0.01），抑制率分別為49%、57%，表明其能抑制H+所致小鼠腹腔毛細血管通透性亢進。體內外實驗結果表明MS具有一定的抗炎活性。

本研究是在藥典記載MS的有效劑量下開展的其抗炎作用的研究，結果顯示MS具有一定的抗炎活性，但它在疾病模型中是否還能發揮其抗炎活性及如何發揮將是筆者下一步研究的重點。本課題組將結合本研究結果進一步開展其保肝、抗炎免疫調節作用的實驗研究，同時開展其保肝作用物質的基礎研究。

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Expeeimental study on the anti-inflammatoey effect of Cichorium glandulosum Boiss.et Huet aqueous exteacts

YANG Qiaoli WANG Xue MA Xueping LIU Yan SILijun SHIYuzhu

Xinjiang Institute of Materia Medica，Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830004，China

R285.5

A

1674-4721（2016）08（c）-0027-04

2016-04-09本文編輯：張瑜杰）

新疆維吾爾自治區公益性科研：所基本科研業務經費資助項目（KY2014061）。

楊巧麗（1979-），女，碩士；研究方向：中藥藥理與藥效學。