來源于電子垃圾污染地區的重金屬抗性菌株研究

胡　昱，陳　飚，闞　劼，張青巖，黃通旺*

（1.汕頭市金山中學，廣東汕頭　515063；　2.汕頭大學生物系，廣東汕頭　515063）

來源于電子垃圾污染地區的重金屬抗性菌株研究

胡昱1,a，陳飚2,a，闞劼2，張青巖1，黃通旺2*

（1.汕頭市金山中學，廣東汕頭515063；2.汕頭大學生物系，廣東汕頭515063）

通過對電子垃圾污染環境來源的樣品利用選擇性培養基進行微生物培養與純化，分離、篩選出12株對重金屬銅（Cu2+）具有較高抗性的菌株；其中，菌株HZB同時對鉻（Cr2+）和鎘（Cd2+）也具有較高的抗性.通過對菌株HZB的生理生化特性及16S rDNA序列進行分析，結果表明菌株HZB屬于蠟狀芽孢桿菌，它在中性環境中生長良好.利用重金屬最低抑制濃度的檢測，發現菌株HZB能單抗4.2 mmol/L的Cr2+、2.5 mmol/L的Cu2+和0.7 mmol/ L的Cd2+.在Cu2+的環境中，菌株HZB對Cu2+具有明顯的吸附作用；并且在應激和適應的狀態下，菌株HZB顯示出相似的吸附曲線.曲線擬合結果表明，在適應的狀態下，HZB菌體對Cu2+的吸附更符合Langmuir吸附理論.

重金屬；抗性菌株；銅離子；電子垃圾

當今世界環境問題日益突出，被淘汰及廢棄的電器、電子產品所形成的電子垃圾造成的環境污染問題也越來越引起人們的重視.據統計，全世界每年約有4 000萬噸廢舊電子產品被丟棄，其中約70%在中國拆解與遺棄［1］.汕頭貴嶼、清遠龍塘等電子垃圾拆解區每年處理電子垃圾近百萬噸，主要采用手工拆解、焚燒、填埋等粗放式的處理方式［2］.電子垃圾電器元件含有砷、鉛、鉻、銅、汞等重金屬和其它多種有害物質，很容易對土壤和水體造成嚴重污染［3］.

自然界中存在種類繁多的微生物，其中有許多對重金屬具有抗性，在含有重金屬的環境中能良好的生長，同時在形態、生理、遺傳上顯示出某些特定的生物學反應［4］；而且微生物在修復被重金屬污染的環境方面具有獨特的作用.本課題組［5］前期研究了貴嶼受電子垃圾污染地區的土壤和沉積物樣品的重金屬污染狀況，發現其中Cu和Pb超標嚴重，Zn的含量也處于較高水平；同時，利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析、構建16S rRNA文庫，證實污染地區樣品中存在豐富的微生物類群，其中變形菌門和未定義的門類含量最高，分別為40%和28%.本研究進一步從受電子垃圾污染地區的土壤中分離純化了對重金屬具有抗性的微生物菌株，并對其中的典型菌株特性以及對重金屬抗性進行了研究，為微生物修復受重金屬污染環境積累資料.

1　材料與方法

1.1重金屬抗性菌株的分離、篩選

采集汕頭貴嶼的污染土壤和河流沉積物樣品，裝于無菌采樣瓶中，4℃儲存送回實驗室，24 h內進行實驗.將樣品10 g溶于含90 mL無菌蒸餾水和玻璃珠的三角瓶中，在25℃搖床于220 r/min振蕩1 h；靜置30 min后取上清，做梯度稀釋并涂布在牛肉膏瓊脂平板上，25℃溫箱避光培養2天.挑取平板中的單菌落，在牛肉膏瓊脂平板上進行劃線培養，挑取單菌落劃線培養，連續三次培養出單菌落，且其性狀沒有發生改變，即得到純的菌株.

為了進行抗重金屬銅的菌株初選，設置含較高銅濃度2.0 mmol/L牛肉膏液體培養基對所純化得到的株進行25℃搖床于220 r/min振蕩培養，觀察其生長情況，得到重金屬抗性菌株.

1.2菌株生理生化特性研究

準備250 mL液體牛肉膏培養基，以1%接種量接種后混勻，25℃下震蕩培養，每1.5 h取5 mL于一支試管中在4℃冰箱里凍存，最后一起測定其OD600的值，以測定菌株的生長曲線.

設計pH梯度5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0培養24 h，測量其OD600的值，以測定不同pH對菌株生長的影響.

1.3菌株16S rRNA基因序列分析

依照細菌16S rDNA基因中最保守的序列，采用正向引物F26：5-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3；反向引物R1492：5-CGG CTA CCT TGT TAC GAC TTC-3對菌株進行菌落PCR，挑取單菌落于20 μL無菌水中，100℃水浴7 min，12 000 rpm離心5 min，取1 μL上清液作為PCR模板.30 μL反應體系：10×PCR Buffer（with Mg2+）3 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）2 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，加MilliQ水至30 μL.反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸30 s，33個循環，72℃最終延伸9 min.PCR反應的產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；產物經純化后克隆于pUCm-T載體，并轉化入DH5α.經過抽提質粒和PCR驗證正確后，送基因測序公司測定其DNA序列，最后將測定的序列提交GenBank數據庫，與數據庫中已有的16S rRNA基因序列進行相似性比較分析.用ClustalX進行序列比對后采用MEGA4.0軟件進行系統發育分析.

1.4菌株重金屬最低抑制濃度（MIC）的測定

挑取抗性菌株的單菌落于新鮮的牛肉膏液體培養基中，25℃振蕩培養，待菌液比較渾濁時，移取1%的接種量至含有新鮮定量的牛肉膏液體培養基中，25℃繼續振蕩培養，待OD600值達到0.2左右，在其中加入相應的重金屬濃度，24 h后取出，檢測菌體生長狀況.

1.5菌株重金屬吸附能力測定及反應動力學研究

將斜面保藏的菌株活化后制成菌懸液，25℃振蕩培養，待菌液比較渾濁時，移取1%的接種量至含有新鮮定量的牛肉膏液體培養基中，25℃繼續振蕩培養；待OD600值達到0.2左右，在其中加入相應的重金屬濃度，每3 h后取出一定菌液；10 000 r/min離心5 min收集上清液，用原子吸收分光光度計測定上清液中金屬的濃度并計算吸附率.以加有等量去離子水的液體培養基為對照，以對菌株對重金屬吸附的反應動力學進行測定［6］.

2　結果與討論

2.1電子垃圾污染地區來源重金屬抗性菌株的分離

從汕頭貴嶼受電子垃圾污染地區的樣品中，初步分離到12株具有抗Cu2+能力的菌株，其菌落形態差異明顯（如表1所示）；與本課題組前期研究獲得的結果一致［5］.

選取其中抗Cu2+能力強的菌株HZB，鑒定其菌種，并進一步研究其生理生化特性和抗重金屬能力.

2.2菌株HZB的生理生化特性及鑒定

2.2.1生理生化特性

從菌落形態上觀察，菌株HZB為圓形、凸起菌落，其邊緣整齊，呈乳白色，表面光滑；顯微鏡觀察為短桿菌，經革蘭氏染色為陽性菌.通過對其生理生化特性分析，結果顯示該菌株為氧化酶陽性，甲基紅陽性，V-P試驗陽性，吲哚試驗陰性.

表1　具重金屬銅抗性菌株初步篩選結果統計

對菌株HZB進行培養，測定其OD600以確定其生長曲線，結果如圖1所示.菌株在25℃振蕩培養，于4 h后進入對數生長期，在20 h后達到生長后期，24 h后進入衰減期.

為了測定不同pH值對菌株生長的影響，設計pH梯度5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0培養24 h，測量OD600的值，其生長狀況如圖2.菌株在不同的pH值的液體培養基中培養都能達到OD600為0.6左右的最高菌體濃度，因為所用的pH值偏于酸，說明菌株對不同的pH值具有較強的適應能力.

進一步分析發現，菌株在較低pH值（如5.5、6.0、6.5）達到生長最高峰所需的時間要比在較高pH（如7.0、7.5、8.0）的要長，說明不同的pH值對菌株的生長速率有一定的影響.為了研究菌株的抗重金屬能力，后續的實驗都選擇在pH值7.0的條件下進行.

圖1　菌株HZB的生長曲線

圖2　不同pH值培養下菌株HZB的生長曲線

2.2.2菌株16S rRNA基因序列分析

取菌株HZB單菌落，對其16S rRNA基因中最保守的序列進行測序.對測定后的16S rRNA基因序列進行BLAST比對分析（如圖3），發現菌株HZB與Bacillus cereus的菌株相似性達99%，因此初步將其歸于Bacillus屬，并命名為Bacillus sp.HZB，同時將其序列提交到Genbank（基因序列號為FJ790330）.

早在1977年就有人發現了Cu2+能刺激B.cereus菌產生重金屬結合能力的銅蛋白糞卟啉Ⅲ［7］.對B. cereus菌株抗重金屬汞的研究有多篇報道，在一株能在50 mM HgCl2條件下生長的B.cereus中，研究者發現Hg2+能增加細菌還原性NADPH的產量［8］；從受汞嚴重污染的帕麗卡湖底沉積物中分離出一些具有汞抗性的B.cereus菌，實驗表明這些菌的汞抗性是由染色體基因決定的，其中有5個菌株具有merA和merB3基因，而其它不具備這些基因的B.cereus菌可能具有其它抗汞的機制［9］.

圖3　菌株HZB的16S rRNA基因系統進化樹

2.3菌株對重金屬的最低抑制濃度（MIC）

最低抑菌濃度（MIC）是指在體外試驗中，各種重金屬能抑制培養液中細菌生長的最低濃度，MIC值越大，重金屬對菌體的毒性越小；相反，其對菌體的毒性就越大.本實驗通過測定Cr2+、Cu2+和Cd2+三重金屬離子對菌株的毒性，獲得結果如圖4所示.菌株HZB具有單抗4.2 mmol/L Cr2+、2.5 mmol/L Cu2+和0.7 mmol/L Cd2+的能力.

Maiti等［10］發現B.cereus菌對Cd2+、Zn2+、Cu2+和Pb2+等都具有較強的抗性，說明B.cereus菌的重金屬抗性的獨特性質.曾奇玉等［11］研究發現腸桿菌ZM-12具有較強的Cu2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+耐受性，在不同種類的重金屬培養基中，其MIC值各不相同，菌株ZM-12對Cu2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+的MIC值分別為22.33 mmol/L、14.48 mmol/L、＞200 mmol/L和58.69 mmol/L.

2.4菌株HZB對Cu2+的吸附能力及反應動力學

將斜面保藏的菌株活化后制成菌懸液，25℃振蕩培養，待菌液比較渾濁時，移取1%的接種量至含有新鮮定量的牛肉膏液體培養基中，25℃繼續振蕩培養，待OD600值達到0.2左右，在其中加入Cu2+，每3 h后取出一定菌液，10 000 r/min離心5 min收集上清液，用原子吸收分光光度計測定上清液中金屬的濃度并計算吸附率，并把這種情況設定為應激抗性的情況.

另設一個適應的情況，在含重金屬的培養基中培養菌株，使其達到適應重金屬濃度的狀態，移取1%的接種量至含有新鮮定量含重金屬Cu2+的牛肉膏液體培養基中，25℃繼續振蕩培養，每3 h后取出一定菌液，10 000 r/min離心5 min收集上清液，用原子吸收分光光度計測定上清液中金屬的濃度并計算吸附率.

圖4　不同重金屬對菌株HZB的最低抑制濃度

圖5　菌株HZB對重金屬銅在不同時間長度下的吸附量

菌株HZB吸附Cu2+過程如圖5、6所示，表明在生長周期中菌株對Cu2+的吸附量隨時間的增長而增加，以1%接種量在24 h后，吸附量達到了2.1 g/mL.但單位菌株Cu2+吸附量有一個先減后增的過程，在15 h菌密度達到最高時，單位菌株Cu2+吸附量最少；而且在不同培養時間段加入重金屬對菌體的生長和吸附也有影響.

通過研究B.cereus、B.subtilis、E.coli和Pseudomonas aeruginosa四種菌株對Ag+、Cd2+、Cu2+、La3+的吸附特性，Mullen等［12］發現P.aeruginosa和B.cereus在1 mM濃度下對Cd2+和Cu2+具有很高的吸附效率；電子顯微鏡檢測顯示La3+的吸附主要集中在細菌的表面，在表面形成針形的簇狀結構，但Cd2+、Cu2+由于不能提供更強的電子，而未能確定其在細菌上的吸附位置.

圖6　在應激和適應生長條件下的單位菌株的重金屬吸附量及菌株生長曲線

Langmuir吸附理論認為固體吸附劑表面均勻地分布著具有吸附能力的位點，每個位點只能吸附一個分子，吸附熱不隨吸附而產生變化.Freundlich吸附理論認為吸附熱隨著吸附量的增加呈對數形式的降低［13］.Lu等［14］用腸桿菌屬的菌株J1開展吸附Pb2+、Cu2+和Cd2+的研究，結果表明菌株J1對Cu2+和Cd2+的吸附能很好的符合Langmuir和Freundlich等溫吸附理論，但對Pb2+的吸附則表現為一種不同的模型；他們認為這可能與細胞內的重金屬積累有關.Maiti等［10］利用固定的B.cereus菌株M1對六價的Cr進行吸附，他們分別檢測了在不同流速、濃度、固定床高度條件下的細菌表面吸附速率和胞內吸附速率，結果表明細菌表面的重金屬吸附起到了決定性的作用.

通過曲線擬合，如圖7～8所示，菌株HZB在適應條件下菌體對Cu2+的吸附更加符合Langmuir吸附理論，其擬合方程R=0.962 0；而Freundlich吸附方程擬合R=0.894 6；說明HZB菌體吸附Cu2+接近于單分子層吸附的理想狀態.

圖7　Langmuir吸附方程擬合（R=0.962 0）

圖8　Freundlich吸附方程擬合（R=0.894 6）

黃志鈞等［15］從四川紅原地區土壤中分離純化得到對Cu2+具有良好抗性的菌株YS-22；利用該菌進行生物吸附研究，結果顯示其對水體中的Cu2+具有良好的吸附性能，吸附行為能很好地符合Pseudo二級動力學模型和Langmuir等溫吸附模型.李蘭松等［16］發現銅抗性細菌BX在優化的條件下，Cu2+吸附率達85.84%，吸附量為128.74 mg/g，其對Cu2+的吸附符合準二級動力學方程和Freundlich等溫吸附模型.

本文從電子垃圾污染地區樣品中獲得了多株具有較高抗重金屬（銅、鉛、鎘）能力的菌株，其中蠟狀芽孢桿菌HZB對銅、鉛、鎘的抗性明顯；并初步研究了菌株HZB的相關特性.進一步深入研究這些菌株的重金屬抗性機制、修復電子垃圾污染地區能力，具有重要的理論意義和應用價值.

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A Study on a Heavy Metal Resistant Strain Isolated from Electronic Waste Pollution Region

HU Yu1，CHEN Biao2，KAN Jie2，ZHANG Qing-yan1，HUANG Tong-wang2
（1.Jinshan Middle School of Shantou，Shantou，Guangdong，515063；2.Biology Department of Shantou University，Shantou，Guangdong，515063）

Twelve strains with a high resistance to heavy metal（Cu2+）were isolated from the electronic-waste sample by selective mediums.Strain HZB，one of the 12 bacteria，exhibited a high resistance to Cr2+and Cd2+，too.It performed the resistance against 4.2 mmol/L of Cr2+，2.5 mmol/L of Cu2+and 0.7 mmol/L of Cd2+，respectively.The results from physiological-biochemical characteristics and 16S rDNA sequence indicated that strain HZB belonged to Bacillus cereus.Under the pressure of copper，strain HZB had an obvious capacity of copper adsorption，and showed similar adsorption curve under the condition of stress and adaptation.The biosorption of HZB toward Cu2+at adaptation of state was in accordance with the Langmuir model.

heavy metal；resistant strain；Cu2+；electronic-waste

X 172

A

1007-6883（2016）03-0078-06

責任編輯朱本華

2016-01-22

廣東省科技計劃項目（項目編號：2012B060400016）.

胡昱（1999-），女，湖南攸縣人，汕頭市金山中學在讀學生.a：并列第一作者，*：通訊作者twhuang@stu.edu.cn.