芬太尼抑制鼻咽癌細胞侵襲轉移的機制研究

任玲，張光哲，邢承忠

(中國醫科大學附屬第一醫院普通外科肛腸外科，遼寧 沈陽　110001)

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芬太尼抑制鼻咽癌細胞侵襲轉移的機制研究

任玲，張光哲，邢承忠

(中國醫科大學附屬第一醫院普通外科肛腸外科，遼寧 沈陽110001)

目的通過選擇10 nmol·L-1芬太尼作用于鼻咽癌細胞系CNE2和HONE1，研究芬太尼對鼻咽癌細胞遷移能力的影響。方法取對數生長期的鼻咽癌細胞系CNE2和HONE1，選擇10 nmol·L-1芬太尼分別作用于鼻咽癌細胞系30 min和1 h，Western blot檢測p-Src和Src表達，Transwell檢測細胞遷移能力；構建Src過表達質粒，轉染鼻咽癌細胞系，觀察鼻咽癌細胞形態，檢測細胞的遷移能力。結果10 nmol·L-1芬太尼處理鼻咽癌細胞CNE2和HONE1 48 h后，細胞呈現出類間質向上皮轉化的形態特征，同時，與對照組相比，加入芬太尼處理組的鼻咽癌細胞其遷移能力顯著降低；應用芬太尼分別處理鼻咽癌細胞30 min和1 h后，p-Src水平顯著下調；此外，與轉染空載體質粒的對照組相比，過表達Src的細胞遷移能力明顯增強，而在過表達Src的細胞中同時聯合芬太尼處理后，細胞的遷移能力沒有被抑制。結論芬太尼可能通過抑制Src通路活化抑制鼻咽癌細胞侵襲轉移。

鼻咽腫瘤;芬太尼;src族激酶類;腫瘤侵潤;腫瘤轉移;藥理作用分子作用機制

鼻咽癌是我國南方和東南亞地區最常見的頭頸部惡性腫瘤。盡管診療技術不斷進步，但仍有60%以上的鼻咽癌患者確診時已發生轉移，預后較差[1]。因此，明確鼻咽癌轉移的分子機制,尋找新的有效治療靶點,抑制轉移發生,是目前鼻咽癌治療所面臨的巨大挑戰。芬太尼是一類阿片受體激動劑，屬強效麻醉鎮痛藥，廣泛應用于晚期鼻咽癌疼痛的患者。有研究證實，芬太尼可以抑制胃癌細胞的增殖和轉移[2]，影響實體腫瘤細胞的生物學行為，但其具體機制尚不清楚。本文將采用10 nmol·L-1芬太尼劑量，作用于體外培養的人鼻咽癌細胞系，探討其對鼻咽癌細胞的侵襲轉移能力的影響及其分子機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞株鼻咽癌CNE2、HONE1細胞株購自上海中科院細胞庫。兩種細胞均培養于RPMI1640完全培養基(含100 mL·L-1滅活胎牛血清、10 g·L-1青霉素-鏈霉素混合抗生素溶液)中，置于37 ℃、50 mL·L-1CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中培養。取生長狀態良好、至對數生長期的細胞進行后續實驗。細胞常規每2～3 d傳代一次。

1.1.2主要試劑芬太尼注射液購自湖北宜昌人福藥業有限責任公司；1640培養基和滅活胎牛血清購自美國英杰生命技術有限公司(Invitrogen)；青霉素、鏈霉素和胰酶均購自美國西格瑪-奧爾德里希公司(Sigma Aldrich)；Transwell小室購自美國康寧公司(Corning)； RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；抗p-Src和Src抗體購自Cell Signaling 公司；抗GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗購自Santa Cruz公司；ECL試劑盒購自于PIERCE公司。

1.1.3質粒和菌株pcDNA3.1(+)購自于美國Invitrogen公司；Src基因表達載體pcDNA3.1-Src質粒委托上海吉凱基因化學技術有限公司構建；大腸桿菌Top10菌株、Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司； RNAiso購自日本Takara公司。

1.2實驗方法

1.2.1質粒抽提和轉染取過夜培養的大腸桿菌Top10菌株50 mL至菌瓶內，按照試劑盒說明書進行質粒擴增提取(北京天根生化科技有限公司)。最后應用紫外分光光度儀檢測濃度和純度。利用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-Src質粒轉染至CNE2細胞，按照試劑說明書進行操作。Western blot方法檢測Src激酶的表達情況。

1.2.2Western blot檢測蛋白變化收集細胞，4 ℃ PBS洗2～3次后加入RIPA細胞裂解液80～100 μL,冰上裂解30 min，之后高速離心(12 000 r·min-1)30 min，取上清。采用Lowry法進行蛋白定量。將樣品與3×上樣緩沖液(北京索萊寶公司)混合后，煮沸5 min，于10%的SDS-聚丙烯凝膠中電泳，隨后電轉移至硝酸纖維素膜上，采用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗p-Src、Src或GAPDH 4 ℃孵育過夜。1×TBST溶液(北京索萊寶公司)清洗4次，每次10 min，隨后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1 h，TBST清洗4次，每次10 min，ECL發光法顯色，采用GIS凝膠圖像分析系統成像并分析處理。

1.2.3Transwell法檢測細胞的遷移能力取對數生長期的CNE2和HONE1細胞，胰酶消化，采用無血清的RPIM1640培養基重懸細胞至每毫升1×105個細胞；Transwell小室上室每孔加入200 μL細胞懸液，加或不加芬太尼注射液(10 nmol·L-1)，下室中加入500 μL含2.5%胎牛血清的RPIM1640培養基，37 ℃培養箱中培養過夜；第2天取出小室，用脫脂棉擦去小室內殘留的液體和濾膜表面的細胞，清水清洗側壁2次，37 ℃風干20 min，結晶紫染色2 h，清水沖洗，風干；切下小室底膜，底面向上置于載玻片上，蓋玻片覆蓋固定，顯微鏡下觀察遷移的細胞數，計數3次取均值。

2　結果

2.1芬太尼注射液誘導鼻咽癌細胞形態改變10 nmol·L-1芬太尼處理鼻咽癌細胞CNE2和HONE1 48 h后，倒置顯微鏡觀察細胞形態。如圖1所示，連接松散、多角形的類間質化的鼻咽癌細胞在經芬太尼處理48 h后，細胞轉變為相對致密且呈島狀生長的類上皮型細胞，并且部分細胞的偽足消失。

注：取對數生長期的鼻咽癌細胞系CNE2和HONE1，10 nmol·L-1芬太尼處理48 h后，倒置顯微鏡觀察細胞形態。

圖1芬太尼誘導鼻咽癌細胞形態改變

2.2芬太尼注射液抑制鼻咽癌細胞的遷移能力Transwell法檢測CNE2和HONE1細胞體外遷移能力。如圖2所示，與對照組相比，加入芬太尼處理組的鼻咽癌細胞的遷移能力顯著降低。

2.3芬太尼注射液抑制鼻咽癌細胞Src通路的激活與對照組相比，鼻咽癌細胞系CNE2和HONE1在經芬太尼注射液分別處理30 min和1 h后，p-Src水平顯著下調(圖3)。結果提示，芬太尼注射液可能抑制了鼻咽癌細胞系中Src通路的內在活化，從而抑制了鼻咽癌細胞的侵襲轉移。

注：鼻咽癌細胞系CNE2和HONE1，加或不加芬太尼10 nmol·L-1處理過夜，Transwell小室檢測細胞遷移能力的變化。與對照組相比較，*P<0.05。

圖2芬太尼抑制鼻咽癌細胞的遷移能力

注：鼻咽癌細胞系CNE2和HONE1，加或不加芬太尼10 nmol·L-1分別處理30 min和1 h，Western blot檢測Src和p-Src的表達情況。

圖3芬太尼抑制鼻咽癌細胞Src通路的活化

2.4過表達Src激酶可以抵消芬太尼對鼻咽癌細胞系遷移能力的抑制經構建Src過表達的pcDNA3.0-Src質粒，瞬時轉染至鼻咽癌細胞系CNE2，再通過Transwell小室檢測芬太尼處理或不處理的CNE2細胞系的遷移能力。結果如圖4所示，Src過表達質粒轉染成功，Src通路激活；與轉染空載體質粒的對照組相比，過表達Src的CNE2-pcDNA3.0(+)細胞系的遷移能力明顯增強；而在過表達Src的細胞中同時聯合芬太尼處理后，較轉染空載體質粒的對照組相比，CNE2-pcDNA3.0(+)細胞的遷移能力并沒有被明顯抑制。以上結果提示，過表達Src激酶可以抵消芬太尼對鼻咽癌細胞系遷移能力的抑制。

注：A.構建Src過表達質粒，瞬時轉染鼻咽癌細胞系CNE2，Western blot檢測Src和p-Src的表達水平；B.構建Src過表達質粒，瞬時轉染鼻咽癌細胞系CNE2，Transwell小室檢測芬太尼處理或不處理CNE2細胞后遷移能力的變化。 轉染空載體質粒組，處理芬太尼后與對照組相比較，*P<0.05；轉染Src過表達質粒與轉染空載體質粒組相比較，**P<0.05；轉染Src過表達質粒聯合芬太尼處理組對比單純轉染空載體質粒組，***P<0.05。

圖4過表達Src激酶逆轉芬太尼對鼻咽癌細胞系遷移能力的抑制

3　討論

芬太尼同嗎啡類似，均是強效的μ受體激動劑，是臨床常用的麻醉性鎮痛藥，適用于創傷性、手術后以及癌性疼痛等。除了強效鎮痛外，近年來諸多的腫瘤基礎研究發現，芬太尼相關的阿片類藥物具有較強抗腫瘤作用，其抗腫瘤機制主要歸納為以下兩個方面：首先是誘導腫瘤細胞的凋亡。有研究報道[2]，芬太尼可抑制胃癌MGC803細胞的生長增殖，促進細胞的凋亡，并改變E2F-1、p53基因的表達。此外，嗎啡可抑制腫瘤細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡[3-5]，并能抑制腫瘤細胞侵襲轉移[6]；其次，芬太尼類藥物可以通過影響細胞因子的表達抑制腫瘤細胞生長。國外研究發現，芬太尼可以抑制大鼠腦缺血再灌注中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-1β的表達，啟動機體的免疫調控機制，從而發揮抗腫瘤機制[7-8]。除了周期阻滯和誘導凋亡機制外，芬太尼可以通過抑制實體腫瘤細胞遷移能力從而發揮抗腫瘤功能，但芬太尼抑制腫瘤細胞遷移的具體分子機制仍不明確。本文首次在人類鼻咽癌細胞系中證實了芬太尼可以抑制腫瘤細胞遷移，并對其分子機制做了深入探討。

Src是一類癌基因，屬于非受體蛋白酪氨酸激酶家族成員之一，主要以兩種形式存在：病毒癌基因表達蛋白v-Src和細胞癌基因表達蛋白c-Src。c-Src蛋白的表達和活性異常參與了很多惡性腫瘤的侵襲轉移以及耐藥等過程[9-13]。c-Src的抑制劑達沙替尼能在體外明顯抑制鼻咽癌細胞通路的活性和FAK蛋白的表達，進一步抑制鼻咽癌細胞的增殖與轉移，促進細胞凋亡。本研究發現，具有高遷移能力的鼻咽癌細胞CNE2和HONE1都具有c-Src激酶的自身活化；芬太尼注射液處理后的鼻咽癌細胞其遷移能力顯著下降；同時，處理過芬太尼的兩種鼻咽癌細胞其c-Src通路被明顯抑制；而過表達c-Src的鼻咽癌細胞系可以抵消芬太尼對鼻咽癌細胞遷移能力的抑制作用。以上結果提示，c-Src激酶的自身活化是導致鼻咽癌細胞遷移的關鍵因子，而芬太尼可以通過抑制c-Src通路活化降低鼻咽癌細胞的遷移能力。

綜上所述，本研究通過體外實驗驗證了芬太尼可以抑制鼻咽癌細胞的遷移能力，并證實了c-Src激酶是參與芬太尼抑制鼻咽癌細胞轉移的調控基因。這些結果為明確阿片類藥物抑制鼻咽癌侵襲轉移的機制奠定了基礎。然而，阿片類藥物與腫瘤的關系相對復雜，其如何在鎮痛作用以外發揮抗腫瘤功能的機制仍需要深入研究。因此，加深對癌性鎮痛藥物的作用靶點和作用機制研究，可以為惡性腫瘤的臨床治療提供新的思路和方向。

[1]Wu S,Xia B,Han F,et al.Prognostic nomogram for patients with nasopharyngeal carcinoma after intensity-modulated radiotherapy[J].PLoS One,2015，10(8):e0134491.

[2]廖淳杰,覃怡,唐小曼,等.芬太尼對胃癌MGC-803細胞E2F-1、p53基因表達的影響[J].臨床麻醉學雜志,2012,28(1):63-64.

[3]Singleton PA,Moss J.Effect of perioperative opioids on cancer recurrence:a hypothesis[J].Future Oncol,2010,6(8):1237-1242.

[4]Gach K,Szemraj J,Wyrebska A,et al.The influence of opioids on matrix metalloproteinase-2 and -9 secretion and mRNA levels in MCF-7 breast cancer lines[J].Mol Biol Rep,2011,38(2):1231-1236.

[5]覃怡,利莉,林育南,等.嗎啡對胃癌細胞 Survivin 和Caspase-9 表達的影響[J].中華實驗外科雜志,2011,28(10):1705-1706.

[6]管恩健,覃怡,利莉,等.嗎啡和芬太尼對人胃癌 MGC-803 細胞遷移能力的影響[J].中華實驗外科雜志,2012,29(11):2178-2179.

[7]Oh WS.Effect of fentanyl on TNF-alpha and IL-1beta levels during global ischemia/reperfusion in rats[J].Int J Tissue React,2002,24(1):11-21.

[8]Narahara H,Kadoi Y,Hinohara H,et al.Comparative effects of flurbiprofen and fentanyl on natural killer cell cytotoxicity,lymphocyte subsets and cytokine concentrations in post-surgical intensive care unit patients:prospective,randomized study[J].J Anesth,2013,27(5):676-683.

[9]Yang Y,Bai ZG,Yin J,et al.Role of c-Src activity in the regulation of gastric cancer cell migration[J].Oncol Rep,2014,32(1):45-49.

[10] Kim WG,Guigon CJ,Fozzatti L,et al.SKI-606,a Src inhibitor,reduces tumor growth,invasion,and distant metastasis in a mouse model of thyroid cancer[J].Clin Cancer Res,2012,18(5):1281-1290.

[11] Xu L,Qu X,Li H,et al.Src/caveolin-1-regulated EGFR activation antagonizes TRAIL-induced apoptosis in gastric cancer cells[J].Oncol Rep,2014,32(1):318-324.

[12] Lee M,Choy WC,Abid MR.Direct sensing of endothelial oxidants by vascular endothelial growth factor receptor-2 and c-Src[J].PLoS One,2011,6(12):e28454.

[13] Samarakoon R,Chitnis SS,Higgins SP,et al.Redox-induced Src kinase and caveolin-1 signaling in TGF-β1-initiated SMAD2/3 activation and PAI-1 expression[J].PLoS One,2011,6(7):e22896.

Mechanism of fentanyl inhibiting invasion and metastasis of nasopharyngeal carcinoma cells

REN Ling,ZHANG Guangzhe,XING Chengzhong

(DepartmentofAnusAndintestineSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversiry,Shenyang,Liaoning110001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of fentanyl on nasopharyngeal carcinoma cells(NPC) metastasis by treating NPClines CNE2 and HONE1 with fentanyl (10 nmol·L-1) in this study.MethodsNasopharyngeal carcinoma cells (CNE2 and HONE1) in logarithmic growth phase were pretreated with fentanyl (10 nmol·L-1) for 30 min and 1 hour.Western blot was used to test the expression levels of p-Src and Src and Transwell test was used to evaluate cell metastatoc ability.Src over-expression plasmid was constructed and transfected into NPC cell lines and NPC cellular morphology and metastatic ability were observed.ResultsNPC cell lines (CNE2 and HONE1) exhibited mesenchymal-to-epithelial like transformation;furthermore,the metastatic ability of NPC cells decreased obviously compared with control group 48 hours after fentanyl treatment.The p-Src expression level was down-regulated after fentanyl treatment for 30 min and 1 hour.However,over-expressive Src enhanced the metastatic ability of NPC cells obviously,and in combination with fentanyl treatmentover-expressive Src plasmid transfection did not inhibit the metastatic ability of NPC cells.ConclusionsFentanyl may inhibit nasopharyngeal carcinoma cells by inhibiting Src pathway invasion and metastasis.

Nasopharyngeal neoplasms;Fentanyl;Src-family kinases;Neoplasm invasiveness;Neoplasm metastasis;Molecular mechanisms of pharmacological action

邢承忠，男，教授,博士生導師，研究方向：胃腸惡性腫瘤的發病與治療，E-mail:174012200@qq.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.051

2016-05-16，

2016-06-15)