白花丹素抑制腎小球系膜細胞增殖及促纖維化相關因子的表達

謝議鳳，王站旗，蘇佩玲

(廣西中醫藥大學第三附屬醫院腎病科，廣西 柳州　545001)

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白花丹素抑制腎小球系膜細胞增殖及促纖維化相關因子的表達

謝議鳳，王站旗，蘇佩玲

(廣西中醫藥大學第三附屬醫院腎病科，廣西 柳州545001)

目的探討白花丹素對人腎小球系膜細胞株HMC細胞增殖及轉化生長因子-β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)、纖維連接蛋白(FN)表達的影響。 方法1～10 μmol·L-1白花丹素分別處理HMC細胞后，MTT法檢測細胞增殖活性；RT-PCR和細胞免疫熒光法分別檢測TGF-β1、CTGF、FN mRNA和蛋白的表達。結果1～10 μmol·L-1白花丹素作用后，HMC細胞呈時間、濃度依賴性生長抑制，TGF-β1、CTGF、FN mRNA和蛋白的表達下降。結論白花丹素通過降低HMC細胞TGF-β1、CTGF、FN的表達，抑制HMC細胞增殖。

白花丹;轉化生長因子β1;結締組織生長因子;連接蛋白類

白花丹素(plumbagin,PL)是我國廣西、云南等地出產的常見草藥白花丹的主要活性成分，具有抗真菌、抗腫瘤、抗細菌、抗凝等多種藥理作用[1]。近來有文獻報道白花丹提取物具有抗小鼠肝纖維化的作用[2]，但是白花丹素是否是其抗纖維化的主要活性物質，其對腎纖維化的影響仍未見報道。本研究擬通過探討白花丹素對人腎小球系膜株HMC細胞的作用，為臨床防治腎臟纖維化提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞株HMC細胞是正常人腎小球細胞細胞株，為T-SV40及H-ras原癌基因轉染的永生系,它保持正常人腎系膜細胞基本的形態學和生物學特征，由南京中大醫院腎內科劉必成教授、江蘇省中醫院腎內科王鋼教授惠贈。

1.1.2試劑白花丹素以二甲基亞砜(DMSO)配制成0.1 mol·L-1存儲液備用，使用時以1640培養液(Gibco)稀釋至相應濃度。DMSO實驗終質量濃度小于0.1%，經預實驗已經證實對HMC細胞無影響。胎牛血清購于武漢三利生物公司。二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)均購自Sigma公司。兔抗人轉化生長因子-β1(TGF-β1)多克隆抗體(Santa Cruz)、兔抗人結締組織生長因子(CTGF)多克隆抗體(Santa Cruz)、兔抗人纖維連接蛋白(FN)多克隆抗人抗體(Santa Cruz)均購于北京中杉金橋生物公司。SABC免疫組織化學檢測試劑盒、FITC標記羊抗兔IgG(Pierce)購于武漢博士德生物有限公司。Trizol試劑(Invitrogen)購于武漢凌飛生物有限公司。逆轉錄擴增試劑盒(Fermentas)購于武漢興華生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養及分組人腎小球系膜細胞株HMC在含有10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1及鏈霉素100 mg·L-1的1640培養基中，37 ℃、5% CO2條件下培養。1～2 d換液一次，3～4 d傳代一次。設置空白對照組(不加藥組)、DMSO對照組(溶劑對照組)；不同濃度(1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol·L-1)白花丹素藥物作用組。

1.2.2細胞體外增殖活性檢測采用MTT比色法。 取3×104·mL-1人腎小球系膜細胞株HMC接種于96孔培養板，每孔100 μL，每組6個復孔。待各藥物分別作用于HMC細胞24、48、72 h后，每孔加入0.5% MTT 20 μL，繼續培養4 h，棄去上清，加DMSO 每孔100 μL，振蕩至結晶溶解，酶標儀490 nm 波長處測定吸光度A值。

1.3RT-PCR檢測TGF-β1、CTGF、FN的表達將接種于6孔板內經不同濃度白花丹素或溶劑作用24 h后的HMC細胞棄去細胞培養液，PBS漂洗后用Trizol試劑盒提取RNA，DNA/RNA測量儀測得RNA濃度，用RT-PCR擴增TGF-β1、CTGF、FN，1.5%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠圖像分析儀(Gene Genius)紫外光下采集圖像并分析。以GAPDH做為內參照，以目的基因與同一標本的GAPDH的RT-PCR產物條帶的吸光度比值來表示其相對含量。見表1。

表1　PCR引物序列

1.4細胞免疫熒光檢測TGF-β1、CTGF、FN 的表達將1×105每孔 HMC接種于24板上，待細胞生長至60%左右加入不同濃度白花丹素或溶劑，24 h后棄去培養基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，0.2%Triton X-100破膜，正常山羊血清封閉，一抗過夜，PBS漂洗后加入FITC標記羊抗兔IgG，室溫孵育30 min后熒光顯微鏡下觀察結果并照相，以PBS作空白對照。結果用Imagepro-plus5.0生物圖像系統在顯微鏡下(200×)隨機觀察5個區域，進行平均吸光度測定。

1.5統計學方法所有數據采用SPSS 12.0統計學軟件進行t檢驗及方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1白花丹素對體外培養HMC細胞增殖的影響如圖1所示，與空白對照組比較，經各濃度白花丹素處理24、48、72 h后，HMC 細胞呈時間、濃度依賴性生長抑制，不同濃度藥物與不同作用時間組之間差異有統計學意義 (P<0.05) ；DMSO對照組細胞生長活性未見明顯抑制 (P>0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

圖1不同白花丹素濃度和作用時間對HMC細胞生長抑制率的影響

2.2白花丹素對HMC細胞TGF-β1、CTGF、FN mRNA的表達的影響如表2和圖2所示，不同濃度的白花丹素處理24 h后， TGF-β1、CTGF、FN mRNA的表達抑制，并呈一定的濃度依賴性(P<0.05)。

表2　白花丹素對HMC細胞TGF-β1、CTGF、FN mRNA的表達的影響

注：與對照組比較，aP<0.01,bP<0.05。

注：A：TGF-β1；B：CTGF；C：FN；D：GAPDH；A～D圖中1.對照組；2～6.白花丹素1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol·L-1組。

注：E.目的基因mRNA/GAPDH的柱狀圖。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖2白花丹素對HMC細胞TGF-β1、CTGF、FN mRNA表達的影響

2.3白花丹素對HMC細胞TGF-β1、CTGF、FN 表達的影響如圖3和表3所示，不同濃度的白花丹素處理24 h后， HMC細胞免疫熒光顯示TGF-β1、CTGF、FN 的表達受抑制，并呈濃度依賴性，不同濃度藥物組之間差異有統計學意義(P<0.05)。

3　討論

腎小球系膜細胞是一種維持正常腎小球結構和功能所必須的腎臟固有細胞。系膜細胞在分泌細胞因子、調節腎小球血流、維持基質的正常代謝等方面發揮重要的生理作用。在病理情況下，損傷后的系膜細胞由靜止狀態轉而表現為細胞增殖活躍，通過自分泌或旁分泌形式釋放多種細胞因子，使細胞外基質產生增加，降解減少，系膜基質聚集[3-4]。過量聚積的系膜基質可以導致毛細血管被擠壓、閉塞、濾過面積減少，最終導致腎小球硬化的發生及腎功能衰退[4-5]。我們的實驗證明首次白花丹素能夠抑制人腎小球細胞細胞株HMC增殖，其抑制增殖作用呈量效依賴關系。

注：1A.TGF-β1空白對照組；1B.5 μmol·L-1白花丹素干預組；1C.10 μmol·L-1白花丹素干預組 (100×)。2A.CTGF空白對照組；2B.5 μmol·L-1白花丹素干預組；2C.10 μmol·L-1白花丹素干預組 (100×)。3A.FN空白對照組；3B.5 μmol·L-1白花丹素干預組；3C.10 μmol·L-1白花丹素干預組 (200×)。

圖3　白花丹素對HMC細胞TGF-β1、CTGF、FN 表達的影響

注：與對照組比較，aP<0.05,bP<0.01。

TGF-β1是作用最強的致腎纖維化細胞因子,腎臟固有細胞及炎細胞均可分泌。TGF-β1是引起腎小球硬化主要介質,可能是通過促進系膜細胞合成細胞外基質,并促進其在系膜區沉積而起作用,是腎損害導致纖維化的最后的和共同的重要中介因子。CTGF是TGF-β1的下游蛋白因子,主要介導TGF-β1促細胞外基質積聚,參與各種組織器官纖維化形成過程[6]。TGF-β1是一個有廣泛生物學活性的蛋白因子,而CTGF具有較特異的促纖維化效應[7]。在增生性成纖維化腎臟病變中,毛細血管外系膜增生病損區、腎小球周圍纖維化區、腎間質纖維化區均有CTGF的強烈表達。CTGF的表達量增加不僅是一種普遍現象,而且它與腎纖維化嚴重程度和進展密切相關。研究表明CTGF可刺激體外培養的人腎小球系膜細胞增生及大量合成FN。FN是具有多種生物性作用重要的細胞外基質成分,通常認為組織/細胞FN表達量的增加與組織的纖維化有著密切的關系[8-9]。研究表明，傳統中藥在防治腎臟損害方面發揮重要作用[10]，探索傳統中藥保護腎臟功能的作用機制為中藥療法的臨床推廣提供了實驗基礎。 我們的實驗結果表明白花丹素可以下調TGF-β1、CTGF、FN水平的表達。

白花丹是我國西南地區的常見植物，為多民族藥材，民間應用廣泛。廣西壯醫稱為“顛邦”或“裸端”；瑤醫稱為“猛老虎”或“三錢三”；云南傣醫稱為“比比篙”。民間已有將白花丹用于肝臟疾病的應用[11]。動物實驗證明白花丹提取物具有抗四氯化碳所致小鼠肝纖維化的作用，但其抗纖維化機制及其有效成分仍不清楚[2]。白花丹素是白花丹主要有效成分，為一種相對分子量為188.18的小分子萘醌化合物。目前發現有抗腫瘤、抗細菌、真菌、螨蟲等多種藥理作用[1,12-15]。白花丹素是否具有抗纖維化作用國內外仍未見報道。通過我們的實驗結果顯示白花丹素在體外能有效的抑制HMC細胞增殖，并抑制腎纖維化相關因子TGF-β1、CTGF、FN的表達，這一作用呈量效依賴關系。

本研究結果提示我們白花丹素可能在體內也具有抑制HMC細胞增殖及TGF-β1、CTGF、FN的表達，減少細胞外基質的積聚，從而發揮延緩腎臟纖維化、保護腎功能的作用。白花丹素在體內對腎纖維化的作用需要我們下一步的動物實驗模型來證明。

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Inhibition effect of plumbagin on proliferation of human glomerular mesangial cell and the mechanisms

XIE Yifeng，WANG Zhanqi，SU Peiling

(DepartmentofNephropathy,TheThirdAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseTraditionalMedicine，Liuzhou,Guangxi545001,China)

ObjectiveTo investigate the effects of plumbagin (PL) on the proliferation of human mesangial cell (HMC) cultured in vitro and the expression of TGF-β1,CTGF,FN in mRNA and protein level.MethodsThe experiment subjects were randomized into control group and five PL groups with different concentrations (1.0,2.5,5.0,7.5,10.0 μmol·L-1),which were treated with DMSO and PL respectively.The proliferation activity of mesangial cells was observed by MTT assay after 24,48,72 hours.The expressions of TGF-β1,CTGF,FN mRNA and protein were detected by RT-PCR and immunofluorescence after 24 hours.ResultsAbsorbance recorded at 490 nm wavelength at different time in PL group was lower than that of control group(P<0.05).Electrophoresis strip density of PCR product and absorbance of immunofluorescence in PL group was significantly lower than that of control group(P<0.05),and a dose and time response relationship was shown in results.ConclusionsPlumbagin can inhibit the proliferation of glomerular mesangial cell by downregulating the expressions of TGF-β1,CTGF,FN in mRNA and protein level.

Plumbago zeylanica;Transforming growth factor beta1;Connective tissue growth factor;Connexins

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.007

2016-05-18，

2016-07-05)