藥用沙棘籽油質量標準研究

趙榮，李聞濤，董彬廠，陳萍

(1.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽　712000；2.陜西省醫(yī)療器械檢測中心，陜西 西安　710075 ；3.陜西省中醫(yī)研究院，陜西 西安　710045)

?

◇藥物分析◇

藥用沙棘籽油質量標準研究

趙榮1，李聞濤2，董彬廠1，陳萍3

(1.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽712000；2.陜西省醫(yī)療器械檢測中心，陜西 西安710075 ；3.陜西省中醫(yī)研究院，陜西 西安710045)

目的研究藥用沙棘籽油的質量標準控制方法。方法(1)采用系列薄層色譜法(TLC)對藥用沙棘籽油進行鑒別。(2)采用HPLC法測定藥用沙棘籽油中的維生素E。色譜柱：Kromasil-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈(78∶22)；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL·min-1。結果(1)采用系列TLC 法對藥用沙棘籽油進行鑒別具有較好的專屬性。(2)維生素E在0.197 2～1.972 mg·L-1的范圍內線性關系良好(r=0.999 7)，平均回收率為99.6%(RSD=0.92%，n=6)。結論所建立的標準科學合理，可用于藥用沙棘籽油的質量控制。

沙棘/標準;色譜法,薄層;維生素E

沙棘具有悠久的藥用歷史，古代中國藏醫(yī)、蒙醫(yī)都將沙棘列為重要的藥用植物。1977年收載進入《中國藥典》，是國家醫(yī)藥局和衛(wèi)生部聯(lián)合公布的藥食同源植物。沙棘籽油是從沙棘種籽提取分離得到的脂肪油，沙棘籽油中除含不飽和脂肪酸外，還含維生素E、熊果酸等多種生物活性成分，現(xiàn)在廣泛的用于藥品、保健品及化妝品等領域[1]。其中維生素E具有組織修復，抗氧化，能增強皮膚毛細血管抵抗力，并維持正常通透性，改善血液循環(huán)及調整生育功能、抗衰老等藥理作用，因此可用于治療燒傷、凍傷、毛細血管出血，預防流產、更年期綜合癥、美容等。國外的沙棘保健食品種類很多，而國內的沙棘保健食品寥寥無幾，其中缺乏沙棘籽油行業(yè)標準和國家標準，導致沙棘籽油的品質良莠不齊[2]，是制約了沙棘類產品的深度開發(fā)的原因之一。為了更好的適應沙棘的醫(yī)藥和保健用途，本文進行了沙棘籽油控制方法的研究，建立了沙棘籽油鑒別和含量控制方法。

1　儀器與試藥

1.1儀器METTLER AE240型電子天平，電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，紫外燈(上海康樂光電儀器有限公司)，硅膠G薄層板(青島海浪硅膠干燥劑有限公司)，美國Waters 2695型高效液相色譜儀(自動進樣器，2487型紫外檢測器，Waters 2414柱溫箱，Empower2色譜工作站)；QTSXR型超聲清洗器(天津市瑞普電子儀器公司)，Millipore超純水機。

1.2試藥沙棘對照藥材(中國食品藥品檢定研究院121519-200912)；沙棘油對照品(中國食品藥品檢定研究院111627-200301)；熊果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院110742-200516)；維生素E對照品(中國藥品生物制品檢定所100062-201110)；甲醇(色譜純，美國Merck公司)；液溴、四氯化碳、石油醚、無水乙醇等試劑均為分析純。

1.3樣品沙棘籽油陜西海天制藥有限公司提供，批號：140507、140801、141001。

2　定性鑒別

取液溴0.1 mL加四氯化碳至10 mL，搖勻，量取2.0 mL置于試管中，滴入本品0.2 mL，振搖0.5 min，液體顏色由紅棕色變成無色或淡黃色。

取含量項下供試品濾液蒸干后的殘渣，加無水乙醇5 mL溶解，作為供試品溶液。另取沙棘對照藥材4 g，同供試品溶液制備方法，殘渣加無水乙醇2 mL溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部0502)試驗，吸取上述兩種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%的磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中在與對照藥材色譜相應位置上，顯相同顏色的藍色斑點。見圖1。

注：1.沙棘對照藥材;2.供試品溶液(批號：140507);3.供試品溶液(批號：140801);4.供試品溶液(批號：141001);5.沙棘對照藥材。

圖1沙棘藥材薄層鑒別圖譜

取本品0.2 mL，加石油醚(60～90 ℃)5 mL溶解，作為供試品溶液。另取沙棘油對照品0.2 mL，同法制成對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶4∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%的磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中在與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的藍色斑點。 見圖2。

取本品2.0 mL，加水-丙酮-石油醚(60～90 ℃)-甲醇-甲酸(1∶2.5∶4.5∶1∶0.2)9.2 mL，振搖，分層，取下層溶液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%的硫酸乙醇溶液，在80 ℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的紫紅色斑點；置紫外光燈下(365 nm)檢視，顯相同的橙黃色熒光斑點。見圖3。

注：1.供試品溶液(批號：140507);2.供試品溶液(批號：140801);3.供試品溶液(批號：141001);4.沙棘油對照品。

圖2沙棘油薄層鑒別圖譜

注：1.供試品溶液(批號：140507);2.供試品溶液(批號：140801);3.供試品溶液(批號：141001);4.熊果酸;5.沙棘對照藥材。

圖3熊果酸的薄層鑒別圖譜

3　維生素E的含量測定

3.1色譜條件色譜柱 Kromasil-C18不銹鋼柱 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈(78∶22)；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃。

3.2對照品溶液的制備精密稱定維生素E對照品98.60 mg，置100 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得維生素E對照品濃溶液。再精密吸取濃溶液10 mL置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得每1 mL中含維生素E 0.197 2 mg的對照品溶液。

3.3供試品溶液的制備取本品5 g，精密稱定，置50 mL圓底燒瓶中，加無水乙醇20 mL，抗壞血酸2 g，沸水浴加熱使沸騰，加氫氧化鉀試液(40→50)10 mL，回流30 min，冷卻后將溶液移入分液漏斗中，加水50 mL，用乙醚200 mL提取3次(100、50、50 mL)。合并乙醚液，用水洗滌乙醚至中性，加無水硫酸鈉約3 g，濾過，濾液在水浴微熱蒸干，殘渣用無水乙醇溶解并定溶至10 mL量瓶中，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.4系統(tǒng)適用性試驗分別精密取無水乙醇試劑空白、供試品溶液、對照品溶液(0.098 6 g·L-1)各10 μL，注入液相色譜儀，依法測定。結果表明，維生素E的保留時間約為22 min，樣品中維生素E與其他組分分離完全，試劑對維生素E測定無干擾，理論板數(shù)按維生素E計算不低于5 000。見圖4。

A.試劑空白

B.對照品

C.供試品

3.5線性關系考察分別精密吸取“3.2”項下對照品溶液各1、2、4、6、8、10 μL ，按上述色譜條件進樣測定，以進樣量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得線性回歸方程：Y=257 655X-3 937.7，r=0.999 7。維生素E在0.197 2～1.972 μg的范圍與峰面積呈良好的線性關系。

3.6精密度試驗取“3.2”項下對照品溶液，在上述色譜條件下重復進樣6次，記錄維生素E的峰面積，并計算RSD值，結果RSD為0.97%。

3.7穩(wěn)定性試驗取同一批供試品溶液(批號：140507)，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、16 h進樣10 μL，依法測定。記錄維生素E的峰面積并計算RSD值，結果RSD為1.33%，表明樣品溶液在室溫放置16 h內基本穩(wěn)定。

3.8重復性試驗分別精密稱取同一批號(批號：140507)樣品6份，按照“3.3”項下的方法制備，依法測定峰面積值并用回歸方程計算含量，結果維生素E的平均含量為0.013 7 mg·g-1，RSD值為0.91%。

3.9回收率試驗加樣回收法，取已知含量的供試品(批號：140507)5 g共6份，精密稱定，置50 mL圓底燒瓶中，分別精密加入維生素E對照品溶液(濃度為0.197 2 g·L-1)1.0、0.6 mL，按“3.3”項下方法制備，依法測定，結果見表1。維生素E的平均回收率為99.6%，RSD為0.92%。

表1　維生素E加樣回收實驗結果(n=6)

3.10樣品測定取沙棘籽油樣品3批次，分別按“3.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，以外標一點法計算樣品中維生素E的含量，結果3批樣品中維生素E的含量依次為：0.013 5、0.010 9、0.012 9 mg·g-1。

4　討論

沙棘籽油是以不飽和脂肪酸為主的植物油，與液溴的四氯化碳溶液顯色反應是不飽和脂肪酸的鑒別反應之一，此方法操作簡便易行、檢驗速度快、結果明顯，故作為沙棘籽油的質量控制手段。

在采用對照藥材的鑒別試驗中，我們選取了(1)甲苯；(2)甲苯-乙酸乙酯(8∶2)；(3)石油醚(60～90 ℃)-甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶2∶0.2)三種展開劑進行試驗，其中展開劑甲苯-乙酸乙酯(8∶2)試驗所得斑點更清晰、色譜信息豐富，故該鑒別試驗采用甲苯-乙酸乙酯(8∶2)為展開劑。

熊果酸、齊墩果酸作為醫(yī)藥、保健的原料，也是沙棘果的活性成分之一。在熊果酸薄層色譜預試試驗，由于熊果酸和齊墩果酸斑點幾乎無法分離，為確定合理的薄層鑒別指標成分，我們通過HPLC分析法考察了沙棘籽油中熊果酸和齊墩果酸的含量，結果檢出熊果酸和齊墩果酸含量極低；通過文獻分析發(fā)現(xiàn)，果皮中熊果酸是齊墩果酸2～4倍[3]，沙棘葉、果實、枝條中熊果酸是齊墩果酸2～3倍[4]，因此選擇熊果酸做為沙棘籽油的質量控制手段。

針對沙棘油的主要活性成分維生素E的測定方法，已報道的有比色法、重量法、極譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法[5-10]等。其中高效液相色譜法具有專屬、可靠、靈敏度高、干擾小等優(yōu)點，故選用高效液相色譜法測定維生素E含量來控制藥用沙棘籽油原料的質量。本研究通過反相高效液相色譜法建立測定藥用沙棘籽油中維生素E含量的方法，該法簡單、快速，將其列入藥用沙棘籽油的質量標準，可以很好地控制其質量。

[1]臧茜茜,鄧乾春,從仁懷,等.沙棘油功效成分及藥理功能研究進展[J].中國油脂,2015,40(5):76-81.

[2]陳明杰,危鳳.制備型高效液相色譜的實驗方法[J].實驗科學與技術,2012,10(4):23-25.

[3]王麗聰.高效液相測定沙棘果皮中熊果酸和齊墩果酸的含量[J].河北化工,2009,32(2):64-65.

[4]滕曉萍,王宏昊,花圣卓,等.HPLC法測定沙棘葉、果實、枝條中齊墩果酸和熊果酸的含量[J].國際沙棘研究與開發(fā),2003,11(4):1-3.

[5]樊明濤,吳守一,馬海樂.維生素E測定方法的研究進展[J].江蘇大學學報(自然科學版),2002,23(1):54-57.

[6]李彤暉,李林,蔣楠,等.沙棘籽中維生素E的含量測定方法研究[J].陜西中醫(yī),2012,33(7):898-899.

[7]姚倩,劉碧崇,費洪新,等.HPLC測定沙棘油中的α-生育酚[J].華西藥學雜志,2009,24(3):314-315.

[8]王兆華,張大軍,趙玉蘭,等.HPLC法測定沙棘油軟膠囊中α-維生素E的含量[J].中草藥,2004,35(1)：48-49.

[9]吳虹,吳健.反相高效液相色譜法測定沙棘油中維生素E 的含量[J].安徽中醫(yī)學院學報,2002,21(1):47-49.

[10] 冉光炳,林彩.舒寧霜中維生素E的鑒別與含量測定[J].中國藥業(yè),2005,14(5):29-30.

Quality standard for seeds oil of Hippophae rhamnaides L.

ZHAO Rong1,LI Wentao2,DONG Bingchang1,et al

(1.ShaanxiHaitianPharmaceuticalCo.,Ltd,Xianyang,Shaanxi712000,China;2.ShaanxiMedicalDevicesTestingCenter,Xi′an,Shaanxi710075,China)

ObjectiveTo establish the quality standard for Seeds Oil ofHippophaerhamnaidesL.MethodsThe Seeds Oil ofHippophaerhamnaidesL.was identified by a series of TLC methods.HPLC was adopted to determine the content of Vitamin E in the seeds oil ofHippophaerhamnaidesL.Kromasil-C18column(250 mm× 4.6 mm，5 μm) was used with methanol-acetonitrile(78∶22) as the mobile phase.The column temperature was set at 30 ℃ with a detection wavelength of 280 nm and a flow rate at 1.0 mL·min-1.ResultsA series of TLC methods for the identification of the seeds oil ofHippophaerhamnaidesL.showed good specificity.For Vitamin E,there was a good linear relationship within the range of 0.197 2～1.972 mg·L-1(r=0.999 5).The average recovery was 99.6% (RSD=0.92%,n=6).ConclusionsThe standard can be use for the quality control of Seeds Oil ofHippophaerhamnaidesL.

Hippophae rhamnoides/standards;Chromatography,thin layer;Vitamin E

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.016

2016-04-21，

2016-07-07)